甲烷是重要的化工原料和化學(xué)能源，在人類(lèi)的生產(chǎn)生活中扮演著(zhù)重要的作用，但是甲烷又是地球大氣中僅次于二氧化碳的第二號溫室氣體。甲烷引起的室效應是同等質(zhì)量二氧化碳的20~30倍。甲烷氧化菌是以甲烷作為生長(cháng)的唯一碳源和能源的微生物。廣泛存在于泥土、沼澤、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。甲烷氧化菌在溫室氣體控制（吸收甲烷）、環(huán)境保護和工業(yè)生物催化中的重要地位，世界各國的科研機構對甲烷氧化菌及其相關(guān)酶系的研究日益增多。本論文分離出一種疣微菌門(mén)甲烷氧化菌，通過(guò)基因編碼解析出這類(lèi)甲烷氧化菌的基因，并且研究該類(lèi)甲烷氧化菌是如何應用地熱能源中的氫氣和甲烷實(shí)現異養和自養生長(cháng)的。

Unisense微電極系統的應用

在生物反應器中應用了unisense氧氣微電極和氫氣微電極測試了甲烷氧化菌生長(cháng)時(shí)，體系中的氫氣和氧化的消耗情況。其中體系中的氫氣和氧氣的濃度消耗是直接將氧微電極或氧微電極是直接插入細胞培養液環(huán)境中測試完成的。其中微電極的矯正采用了兩點(diǎn)法完成的。

實(shí)驗結果

研究發(fā)現疣微菌門(mén)甲烷氧化菌的生長(cháng)是基于混合營(yíng)養體法，該甲烷氧化菌是從酸性地熱田土壤中分離獲得疣微菌門(mén)甲烷氧化菌RTK17.1菌株，該類(lèi)菌株含有氧化氫氣的酶結構，通過(guò)基因組分析證實(shí)，這種菌株編碼了兩種[NiFe]-氫化酶，生化試驗表明該菌能夠利用氫作為有氧呼吸和碳固定過(guò)程中的電子供體進(jìn)行生長(cháng)。這類(lèi)甲烷氧化菌生長(cháng)是夠通過(guò)在地熱資源中利用氫和甲烷來(lái)滿(mǎn)足能量和碳的需求，并且其所需的營(yíng)養液是動(dòng)態(tài)變化的，這也說(shuō)明了這種混合營(yíng)養的生活方式很可能促進(jìn)了這些微生物所占據的生態(tài)位空間的擴展，導致它們在地熱影響表層土壤中分布較多。

圖1、新西蘭地熱田中甲烷、氫氣氧化的地球化學(xué)、生化和分子特征。圖a)表示的是不同溫度下，不同深度土壤的溫度和pHf分布情況。圖b表示的是土壤不同深度處甲烷、氫氣和氧氣混合比例。圖c表示的是不同溫度下，土壤表面甲烷氧化過(guò)程隨時(shí)間的變化過(guò)程。圖d表示的是不同溫度下，土壤表面氫氣氧化隨時(shí)間變化的過(guò)程。圖e表示的是不同土壤深度下甲烷氧化菌的種群結構分布情況。圖f表示的是不同深度下土壤中疣微菌門(mén)甲氧化菌的基因編碼分布情況，具體指的是中疣微菌門(mén)甲氧化菌中有氧吸收氫化酶和顆粒狀甲烷單加氧酶的分布情況。

圖2、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）的氫氣氧化驅動(dòng)的需氧呼吸及二氧化碳固定過(guò)程，圖a表示的是使用細胞生物氧化器培養細胞過(guò)程中的氫氣實(shí)時(shí)氧化過(guò)程速率圖。其中體系中的氫氣的實(shí)時(shí)監測是使用了unisense公司的氫氣微電極測試完成的，圖b表示的是細胞膜中氫化酶的活性監測。圖c表示的是細胞需氧呼吸過(guò)程中對氫氣的依賴(lài)，其中對于氫氣濃度的實(shí)時(shí)監測主要是基于未進(jìn)行任何處理的細胞和經(jīng)過(guò)尼日尼亞菌素處理的細胞。圖d表示的是基于未進(jìn)行任何處理的細胞和經(jīng)過(guò)尼日尼亞菌素處理的細胞的氫氣的氧化速率。圖e表示的是分批的全細胞培養過(guò)程中的二氧化碳的固定。

圖3、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）在氫氣存在條件下進(jìn)行批培養下混養生長(cháng)和自養生長(cháng)情況。圖a表示的是甲烷氧化菌在混合營(yíng)養條件下和自養條件下的生長(cháng)期情況。圖b表示的是混合營(yíng)養生長(cháng)條件下的甲烷氧化速率，以及使用了顆粒甲烷單加酶抑制劑乙炔處理后的混合營(yíng)養生長(cháng)條件下的甲烷氧化速率。圖c表示的氫氣的氧化速率變化情況。圖d表示的是嗜酸的甲烷氧化菌株在有氫氣條件存在以及無(wú)氫氣環(huán)境下的生長(cháng)情況對比。

圖4、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）對于甲烷和氫氣的既定氧化。其中細胞是使用靜態(tài)間歇式生物反應器在50攝氏度下反應培養的，其中固定相培養環(huán)境頂部空間使用的是氮氣中充入不同濃度的二氧化碳、氫氣、甲烷等氣體。其中圖a表示的是氮氣中充入了19%CO2,20%O2,、9%H2，體系中的甲烷、氫氣、氧氣的隨時(shí)間的變化情況。。圖b表示氮氣中充入9%H2、9%CH4體系中的甲烷、氫氣、氧氣的隨時(shí)間的變化情況。圖c表示的是甲烷存在或氫氣存在的條件下，加入10%的氮氣后，體系中的甲烷、氫氣、氧氣的隨時(shí)間的變化情況。

圖5、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）的甲烷和氫氣的氧化模型示意圖。從圖中可以看出該菌在進(jìn)行混合營(yíng)養生長(cháng)時(shí)，氫氣和甲烷的氧化都生產(chǎn)出同等當量的還原產(chǎn)物對苯二酚（QH2），其中的大量的氫質(zhì)子轉移動(dòng)力是基于氫質(zhì)子改變?yōu)镕1F0-ATP和酶產(chǎn)生的的足夠量的ATP能量。對苯二酚則是通過(guò)氫氣氧化提供的電子用于甲烷單甲氧化酶的催化產(chǎn)生的。NADH的還原則是基于甲酸脫氫酶以及氫氣依賴(lài)官能團[NiFe]-氫化酶的作用通過(guò)卡爾文循環(huán)去固定二氧化碳實(shí)現的。

總結

本論文從地熱型酸性土壤中發(fā)現了一株全新的甲烷氧化細菌Verrucomicrobia。這株細菌不同于已知的甲烷氧化菌，可以在高度酸性（pH2.0-2.5）的環(huán)境中生長(cháng)，并且分類(lèi)上與現有的甲烷利用細菌（Methanotroph）屬于不同的門(mén)。研究發(fā)現，該菌含有新型甲烷單加氧酶，利用一種獨特途徑同化甲烷，同時(shí)能夠利用氫作為有氧呼吸和碳固定過(guò)程中的電子供體進(jìn)行生長(cháng)，該菌能夠能夠利用有機物或甲烷作為碳源生長(cháng)，研究過(guò)程中使用了unisense的氫氣微電極和氧微電極正確的測試了進(jìn)行甲烷氧化細菌培養生長(cháng)過(guò)程中的氫氣和氧氣的濃度分布情況，研究表面當細胞培養器氧化亞氮和氧剖面濃度分布情況，從而了解到這類(lèi)甲烷氧化菌的生長(cháng)機制，首次提出了甲烷氧化菌能夠通過(guò)對氫的氧化獲取生長(cháng)的能源，該機理的提出也拓寬了今后甲烷氧化細菌生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究。