結果

溫度和沉積層對沉積物中不同種類(lèi)微囊藻菌落存活的影響

微電極分析表明，含有微囊藻菌落的表層為需氧層，深層為厭氧層（支持材料中的圖S1）。

微囊藻菌落在不同沉積條件下的存活能力如圖2所示。通過(guò)三因素重復方差分析，分析了溫度、微囊藻種類(lèi)和沉積層對微囊藻菌落存活的影響。溫度是顯著(zhù)影響底棲微囊藻菌落存活的唯一因素（P<0.001，表1）。具體而言，25°C的溫度對長(cháng)期存活不利，如相應的事后測試所示。此外，存在顯著(zhù)的溫度-層相互作用（P=0.003），表明層間差異取決于所討論的溫度，反之亦然。三次重復的單因素方差分析顯示，在15°C（P=0.007）和25°C（P<0.001）時(shí)，沉積物深層微囊藻菌落的存活率顯著(zhù)大于表層微囊藻菌落的存活率，而在5°C時(shí)，微囊藻菌落的存活率無(wú)顯著(zhù)差異（P=0.260）。在5°C時(shí)，衛森伯格支原體的存活率顯著(zhù)高于銅綠支原體（P=0.018）。然而，在15°C和25°C時(shí)，衛森伯格支原體和銅綠支原體的存活率沒(méi)有統計學(xué)差異（分別為P=0.740和0.981）。

圖2不同溫度下沉積物表層和深層微囊藻菌落的存活率，表示為存活百分比：5℃下銅綠微囊藻a、5℃下魏森伯格微囊藻b、5℃下微囊藻C、15℃下銅綠微囊藻d、15℃下魏森伯格微囊藻e、15℃下微囊藻f、25℃下銅綠微囊藻g，h M.wesenbergii在25°C下，i.微囊藻在25°C下。根據我們的實(shí)驗前結果，針對不同的溫度設置了不同的采樣間隔

如表1所示，時(shí)間的處理內效應以及時(shí)間與三個(gè)因素（溫度、微囊藻種類(lèi)和層數）之間的關(guān)系都是顯著(zhù)的，表明沉積物中存活微囊藻細胞的密度隨時(shí)間而變化。此外，變化模式因微囊藻種類(lèi)、溫度和沉積層而異。因此，通過(guò)單因素重復方差分析和Tukey事后檢驗，分別研究了不同沉積條件下不同微囊藻群的變化規律。

表1重復測量了14周內溫度（5、15和25°C）和沉積層（表層和深層）對不同種類(lèi)微囊藻菌落（銅綠假單胞菌、魏森伯格微囊藻和這兩種微囊藻的1:1混合物）存活率影響的方差分析

在5°C溫度下，沉積物表層和深層中存活的銅綠假單胞菌的豐度在前18周內沒(méi)有顯著(zhù)變化，僅在第22周下降（分別為P=0.048和0.044）。在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，表層魏森伯格支原體和微囊藻的豐度沒(méi)有顯著(zhù)差異（分別P=0.134和0.191）。在深層，在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，細胞數量具有可比性，但衛森伯格支原體在第18周（P=0.020）和混合微囊藻菌落在第10周（P=0.003）除外。當比較初始（第0周）和最終（第22周）細胞密度時(shí)，僅發(fā)現表層中的銅綠假單胞菌存在顯著(zhù)差異。

在15°C下，在初始滯后期后，表層微囊藻豐度的減少變得相當迅速，此后從第12周到試驗期結束，存活率穩定在約25%。銅綠微囊藻的滯后期為4周（第4周與第6周的P值為0.015），而威森伯格微囊藻的滯后期為2周（第4周與第6周的P值為0.013）。在深層，所有三個(gè)系列的微囊藻菌落在前8周保持穩定，僅在第8周至第12周（銅綠假單胞菌）或第14周（維森貝格氏微囊藻菌落和混合微囊藻菌落）出現明顯損失。隨后，未發(fā)現顯著(zhù)下降，試驗結束時(shí)，所有三個(gè)系列的微囊藻的存活率均保持在50%以上（銅綠假單胞菌為64.58%，韋森貝基微囊藻為59.22%，混合微囊藻菌落為50.80%）。

在25°C下，所有三個(gè)微囊藻系列的動(dòng)力學(xué)表現出相似的趨勢。經(jīng)過(guò)2周的滯后期后，表層微囊藻的存活率降至接近零，直到第12周。在深層，5周的滯后期顯著(zhù)延長(cháng)。銅綠假單胞菌和混合微囊藻菌落的存活率在第14周降至接近零，而衛森伯格假單胞菌的存活率在第12周降至接近零。

底棲微囊藻群體中微囊藻毒素總含量和微囊藻毒素配額的動(dòng)態(tài)

計算并比較了沉積物中微囊藻菌落的總MC含量。MCLR和MC-RR的濃度在所有條件下均表現出良好的相關(guān)性（皮爾遜相關(guān)性，N=192，R=0.980，P<0.001）（圖3）。因此，在本研究中，我們沒(méi)有將它們分開(kāi)，而是將它們統稱(chēng)為BMC^。我們比較了三組微囊藻菌落的存活率：毒性銅綠假單胞菌、無(wú)毒魏森伯格微囊藻菌落和兩種微囊藻的1:1混合物（表示為微囊藻屬）。僅分析了銅綠假單胞菌和微囊藻組的MC含量。MC含量的動(dòng)態(tài)表現在兩個(gè)層面：表層或深層沉積物中所有存活微囊藻菌落的MC總含量和MC配額，其計算方法為總MC含量除以細胞計數的商。微囊藻群的MC配額可能受到銅綠假單胞菌和威森伯格假單胞菌豐度比的影響。因此，僅使用銅綠假單胞菌的MC配額來(lái)反映每個(gè)細胞間MC含量的變化（圖4）。

圖3 5°C下銅綠假單胞菌a和微囊藻PP沉積物表層和深層微囊藻菌落中MC-RR總含量的動(dòng)態(tài)。在5°C下，銅綠假單胞菌在15°C下，d微囊藻PP。在15°C下，銅綠假單胞菌在25°C下，微囊藻屬在25°C下。根據我們的實(shí)驗前結果，針對不同的溫度設置了不同的采樣間隔

圖4 5°C（a）、15°C（b）和25°C（C）條件下沉積物表層和深層中銅綠假單胞菌的微囊藻毒素配額。根據我們的實(shí)驗前結果，針對不同的溫度設置了不同的采樣間隔

溫度和沉積層顯著(zhù)影響沉積物中微囊藻菌落的總MC含量（表2）。在較低溫度下，微囊藻菌落的總MC含量在深層顯著(zhù)較高。此外，存在顯著(zhù)的溫度-層相互作用（P=0.003），表明層間差異因溫度而異。

表2重復測量溫度（5、15和25°C）和沉積層（表層和深層）對微囊藻菌落（銅綠假單胞菌、1:1的銅綠假單胞菌和韋森伯格假單胞菌混合物）MC-RR總含量影響的方差分析

在不同溫度下分別進(jìn)行單向重復方差分析和Tukey的事后檢驗。在5°C下，整個(gè)試驗期間，銅綠微囊藻和混合微囊藻菌落中的MC總含量沒(méi)有顯著(zhù)差異（表層銅綠微囊藻，P=0.062；表層微囊藻屬，P=0.065；深層銅綠微囊藻，P=0.137；深層微囊藻屬，P=0.087）。通過(guò)兩兩比較，第22周表層菌落的總MC含量顯著(zhù)低于其他采樣日期。在15°C和25°C時(shí)，銅綠假單胞菌中的總MC含量在實(shí)驗期間顯著(zhù)下降（P<0.05）。在15°C的深層，銅綠假單胞菌和微囊藻菌落的總MC含量在前8周保持穩定（銅綠假單胞菌，P=0.167；微囊藻，P=0.088），并從第10周到實(shí)驗結束顯著(zhù)下降。在15°C的表層中，MC的總含量在第二周或第四周開(kāi)始顯著(zhù)降低，在其余的實(shí)驗期間，這種降低趨勢持續。在25°C時(shí)，銅綠假單胞菌和微囊藻菌落的總MC濃度在前5周迅速下降，隨后在表層和深層均保持較低水平。表層銅綠假單胞菌細胞中MC濃度顯著(zhù)低于深層銅綠假單胞菌（P<0.001）。

溫度和沉積層顯著(zhù)影響綠膿桿菌的MC配額（P<0.001，表3）。在較高溫度（25°C）和表層，銅綠假單胞菌的微囊藻毒素配額顯著(zhù)降低。時(shí)間的內處理效應，以及時(shí)間與溫度和層之間的關(guān)系都是顯著(zhù)的。

表3重復測量了14周內溫度（5、15和25°C）和沉積層（表層和深層）對銅綠假單胞菌微囊藻毒素配額影響的方差分析

對每個(gè)溫度進(jìn)行單因素方差分析和Tukey的事后檢驗。與三因素方差分析的統計結果不同，根據單因素方差分析（5°C，P=0.062；15°C，P=0.449；和25°C，P=0.371），兩層沉積物中銅綠假單胞菌的MC配額之間未發(fā)現顯著(zhù)差異。在5°C時(shí)，第一周銅綠假單胞菌的MC配額與第6、第10和第22周的MC配額相當，但顯著(zhù)低于或高于第2、第14和第18周的MC配額。在15°C時(shí)，只有第2周和第14周的MC配額與初始值顯著(zhù)不同。在5°C和15°C下采集的樣品中，銅綠假單胞菌的MC配額沒(méi)有顯著(zhù)差異。雖然在一些采樣日期存在波動(dòng)，但微囊藻毒素配額在5°C和15°C下在表層和深層沉積物中基本穩定。在25°C下，任何采樣日期的MC配額都明顯低于實(shí)驗開(kāi)始時(shí)。

沉積物中微囊藻群體光合活性的動(dòng)態(tài)

使用三因素重復方差分析測試分析溫度、微囊藻種類(lèi)和層數對微囊藻菌落Fv/Fm的影響（圖5）。溫度和沉積層顯著(zhù)影響底棲微囊藻菌落的Fv/Fm（P<0.01，表4）。在所有沉積條件下，微囊藻的Fv/Fm逐漸降低，在較高溫度（P<0.001）和表層（P=0.002）下，Fv/Fm的下降百分比增加。毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒韋森伯格假單胞菌的Fv/Fm無(wú)顯著(zhù)差異（P=0.320）。

圖5不同溫度下沉積物表層和深層微囊藻的有效量子產(chǎn)率（單位：PSII（Fv/Fm））。銅綠假單胞菌在5°C時(shí)，銅綠假單胞菌在5°C時(shí)，銅綠假單胞菌在5°C時(shí)，銅綠假單胞菌在15°C時(shí)，銅綠假單胞菌在15°C時(shí)，銅綠假單胞菌在15°C時(shí)，銅綠假單胞菌在25°C時(shí)，銅綠假單胞菌在25°C時(shí)，銅綠假單胞菌在15°C時(shí)，銅綠假單胞菌在15°C時(shí)，銅綠假單胞菌在15°C時(shí)，銅綠假單胞菌在25°C時(shí)，銅綠假單胞菌在25°C時(shí)，銅綠假單胞菌在25°C時(shí)，銅，根據我們的預實(shí)驗結果

表4重復測量了14周內溫度（5、15和25°C）和沉積層（表層和深層）對綠膿桿菌光合活性影響的方差分析

治療時(shí)間內的療效顯著(zhù)。微囊藻菌落的豐度開(kāi)始下降之前有一段滯后期。然而，在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，Fv/Fm值顯著(zhù)降低。時(shí)間與三個(gè)因素（溫度、微囊藻種類(lèi)和層）之間的關(guān)系顯著(zhù)，表明下降速度受微囊藻種類(lèi)、溫度和沉積層的影響。

討論

在這項研究中，我們考察了在受控實(shí)驗室條件下，考慮溫度和氧氣的影響，底棲微囊藻菌落的存活能力。我們不打算在不同溫度下模擬底棲微囊藻群落的整個(gè)壽命，因為淺水湖泊中沉積物的溫度是周期性的，并隨季節變化。相反，我們采用了為期4-6個(gè)月的模擬試驗來(lái)評估底泥中微囊藻菌落的存活能力。

在5°C條件下，表層和深層沉積物中的微囊藻菌落豐度在實(shí)驗結束時(shí)（第22周）沒(méi)有顯著(zhù)減少，表層中的銅綠假單胞菌除外。在15°C和25°C時(shí)，沉積物中微囊藻菌落的豐度在初始滯后期后迅速下降，隨后存活率穩定下來(lái)，直到實(shí)驗結束。物流模型（方程式1）大致符合沉積物中微囊藻菌落在15°C和25°C下存活百分比的動(dòng)態(tài)：

其中t、y、t0和p分別代表采樣時(shí)間、沉積物中微囊藻的存活百分比、中心時(shí)間和功率。A1和A2代表存活率穩定的初始值和最終值。通過(guò)對模型進(jìn)行一階導數，得到了變化過(guò)程的開(kāi)始時(shí)間和結束時(shí)間，分別用t1和t2表示。也就是說(shuō)，微囊藻細胞的存活率在t1的初始滯后期后開(kāi)始下降，此后存活率從t2到試驗期結束穩定在A(yíng)2（表5）。

表5根據邏輯模型計算的15或25°C條件下不同沉積物層中微囊藻菌落的存活百分比

較大的初始延遲時(shí)間（t1）和最終存活率（A2）可以反映較高的存活率。由于在5°C下22周的實(shí)驗過(guò)程中幾乎沒(méi)有發(fā)現任何顯著(zhù)的下降，t1和A2可分別被視為22周和100%。通過(guò)比較不同條件下微囊藻菌落的t1和A2，我們得出以下結論：（1）低溫有利于微囊藻菌落在沉積物中更長(cháng)的存活時(shí)間，（2）銅綠假單胞菌的最終存活百分比（表5中的A2）在15℃和25℃時(shí)高于衛森伯格微囊藻，深層微囊藻的存活率顯著(zhù)高于表層微囊藻。微囊藻菌落的存活能力可與植物種子的存活能力相比較，植物種子埋在土壤中時(shí)，可作為下一季萌發(fā)的種子庫；硬殼種子可以在土壤中存活數十年，同時(shí)在適當條件下保持發(fā)芽能力。因此，沉積微囊藻菌落也可以被認為是一種種子庫；在野外條件下，微囊藻形成由數十個(gè)、數百個(gè)或數千個(gè)細胞組成的菌落，細胞被厚厚的鞘覆蓋。就像種子的外殼一樣，微囊藻菌落的鞘可以保護微囊藻細胞免受不利的底棲條件的影響。低溫和厭氧條件促進(jìn)了種子和底棲微囊藻群體的長(cháng)期存活（Andrade，2001年）。

溫度是影響沉積物中微囊藻菌落存活的最重要因素。在5°C溫度下22周的實(shí)驗過(guò)程中，微囊藻數量幾乎沒(méi)有顯著(zhù)減少，而在25°C溫度下，超過(guò)90%的底棲生物種群在3個(gè)月內消失。這些結果與現場(chǎng)調查結果一致。例如，微囊藻菌落可以在格蘭根特湖（法國）的沉積物中存活長(cháng)達6年，那里的溫度總是低于10℃（Misson等人，2012a）。在德國Quitzdorf水庫的另一個(gè)湖泊的沉積物中，當溫度在再侵入階段持續高于12°C時(shí)，65%到85%的底棲微囊藻群落死亡（Ihle等人，2005年）。本研究定量揭示了沉積物中微囊藻菌落的存活情況。根據我們的研究結果和亞熱帶淺水湖泊溫度的實(shí)際季節變化，大多數底棲微囊藻群落能夠成功越冬，因此有可能在第二年春天接種水柱，但它們不能在亞熱帶淺水湖泊的沉積物中積累多年。

氧氣水平是決定底棲微囊藻菌落存活的另一個(gè)因素。微囊藻菌落在好氧表層沉積物中的存活率顯著(zhù)低于厭氧深層沉積物。如表1所示，在15°C下放置17周后，上層沉積物中微囊藻菌落的豐度下降，存活率低于20%，而深層沉積物中的種群減少率低于50%。其他研究人員也報告說(shuō)，沉積物表層中有更高比例的微囊藻菌落消失（Brunberg和Blomqvist，2002年；Ihle等人，2005年），這可能是再侵入和細胞溶解的結果。其他藍藻，如圓柱狀振蕩藻，也對氧敏感，在還原條件下比有氧條件下存活更長(cháng)（Richardson和Castenholz 1987）。

毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒維森伯格假單胞菌具有相似的存活能力，盡管銅綠假單胞菌在15°C和25°C下的最終存活效率（表5中的A2）高于維森伯格假單胞菌。一些研究人員發(fā)現，MCs可能參與了底棲微囊藻的存活機制。因此，有毒微囊藻菌落可能比無(wú)毒菌落更容易越冬（Ihle等人，2005年；Misson等人，2012a）。然而，在我們的研究中，毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒維森伯格假單胞菌的存活率沒(méi)有顯著(zhù)差異。覆蓋鞘的厚度可能是影響微囊藻生存能力的關(guān)鍵因素。在沉積物中，有鞘光養生物比無(wú)鞘光養生物壽命更長(cháng)（J?rgensen等人，1988年）。銅綠假單胞菌的鞘比維森伯格假單胞菌的鞘薄得多。因此，有毒銅綠假單胞菌中的MC可能有利于其長(cháng)期存活。然而，這一優(yōu)勢可能被銅綠假單胞菌較薄的鞘層所抵消。在另一項研究中，在沉淀物中埋藏6年和33年的底棲微囊藻種群之間，未發(fā)現有毒和無(wú)毒細胞比例的顯著(zhù)差異（Rinta Kanto等人，2009年）。需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示細胞內MC在底棲微囊藻菌落存活中的生理作用。

在5℃和15℃下，微囊藻細胞中的MC含量在實(shí)驗期間基本保持穩定。因此，可以推斷，在黑暗條件下，沉積物中不會(huì )產(chǎn)生MCs。此外，底棲微囊藻保存的MCs沒(méi)有作為碳源消耗或釋放到周?chē)h(huán)境中。然而，在25°C時(shí)，微囊藻細胞的MC配額顯著(zhù)降低。在此溫度下，微囊藻細胞的光合活性顯著(zhù)降低。微囊藻細胞膜也可能受損，細胞間MC可能從細胞中釋放，導致MC配額下降。Wu等人（2015年）還發(fā)現，新鮮藍藻樣本中的細胞內MC在細胞破裂之前不會(huì )迅速減少。對于野生樣本，微囊藻種群包括有毒和無(wú)毒兩種形式。因此，現場(chǎng)樣本中MC配額的波動(dòng)可能主要取決于有毒和無(wú)毒細胞的相對比例，而不是有毒細胞的細胞內MC含量水平。在我們的研究中，定量測定了群體微囊藻菌株純培養物中細胞內MC的動(dòng)態(tài)，從而消除了群落組成的任何潛在影響，并提供了更具針對性的結果。底棲微囊藻群體的光合活性逐漸下降，在較高溫度下下降幅度較大。我們的研究結果和其他研究結果表明，在沒(méi)有光照的情況下，沉積物中PSII的光化學(xué)效率逐漸降低（Sch?ne等人，2010）。當溫度低于15°C時(shí)，毒性細胞和無(wú)毒細胞的存活率沒(méi)有顯著(zhù)差異，細胞內含量穩定。因此，在越冬和再入侵期間，底棲微囊藻種群的毒性沒(méi)有顯著(zhù)變化。

結論

在這項研究中，我們系統地研究了微囊藻菌落在表層和深層沉積物中，在不同季節對應的不同溫度下的存活能力。低溫和厭氧條件促進(jìn)了底棲微囊藻菌落的長(cháng)期存活。毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒魏森伯格假單胞菌表現出相似的存活能力，在實(shí)驗期間，底棲微囊藻細胞的MC含量在5℃和15℃下保持穩定。因此，在越冬和再入侵期間，底棲微囊藻種群的毒性沒(méi)有顯著(zhù)變化。我們的研究表明，大多數底棲微囊藻群體能夠成功越冬，微囊藻毒素得以保存，光合活性得以維持，顯著(zhù)增加了水華形成的風(fēng)險。因此，需要采取疏?；蚋采w沉積物等人工措施，以避免沉積物中累積微囊藻菌落的不利影響。在夏季，當亞熱帶淺水湖泊的溫度較高（例如25°C）時(shí)，底棲生物種群的存活率在3個(gè)月內降至接近零。因此，底棲微囊藻種群不能在亞熱帶淺水湖泊的沉積物中積累多年。

致謝

中國國家自然科學(xué)基金（31270509和31370504）、中國水污染防治與治理重大科學(xué)技術(shù)計劃（2013ZX07102005）、國家淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室（2016FB10）等國家科學(xué)基金資助項目（41561144008和）。作者感謝有害藻類(lèi)團隊的所有成員，特別是中國科學(xué)院水生生物研究所的李仁輝教授，感謝他們對微囊藻菌株的純培養和儀器的幫助。我們還要對袁曉博士（中國科學(xué)院水生生物研究所分析測試中心）的儀器支持表示最深切的感謝。