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看法
探針耗氧量的方法學(xué)方法。 為了確保微探針的耗氧量與細菌的耗氧量相比可以忽略不計，我們在24小時(shí)內平行培養過(guò)程中監測了相同水的0.6-μm和0.2-μm過(guò)濾子樣本中的氧濃度（圖2）。 0.2-μm過(guò)濾水中的氧濃度在培養0至15 h期間保持恒定（215μm O2，圖2）。 培養15小時(shí)后觀(guān)察到的減少是由于通過(guò)過(guò)濾器的殘留小細菌的生長(cháng)和/或由于儀器無(wú)法進(jìn)行高壓滅菌而污染樣品造成的。 對于在含有大多數細菌的0.6μm（圖2）上過(guò)濾的樣品（平均值為90%±4%，n=31，Torréton等人未經(jīng)過(guò)濾的數據未經(jīng)過(guò)濾），這種殘留污染可以忽略不計。 微探針不消耗氧氣是一個(gè)相當大的優(yōu)勢，因為在浮游水域中使用的大多數氧氣測量設備都涉及氧氣宏觀(guān)探針（Griffith 1988；Langdon 1993），其顯示內部氧氣消耗，導致氧氣消耗的高估，除非糾正。
圖2. 站N12（2003年5月6日）0.6-和0.2-μm過(guò)濾子樣本暗培養期間的氧氣濃度。
再現性。 使用Winkler方法的耗氧量估計通常是重復進(jìn)行的。 在我們的研究中，測量氧氣濃度的設備的可用性使我們無(wú)法在重復中系統地估計氧氣消耗量。 然而，在一些情況下，我們檢查了重復水樣的再現性。 圖3顯示了同一站點(diǎn)的兩個(gè)樣本中氧氣濃度的時(shí)間過(guò)程非常相似。
圖3. 在N12站（2003年4月10日）0.6-μm過(guò)濾子樣本的黑暗培養期間的氧氣濃度。
氧微探針的精密度。 表2顯示了用于測量浮游生物系統中氧濃度的不同技術(shù)。 Winkler技術(shù)是最常用的技術(shù)，已經(jīng)開(kāi)展了許多工作來(lái)提高這種化學(xué)測定氧濃度的精度。 氧微探針的精度（0.05%）相當于Roland等人（1999）和Sherr及Sherr（2003）所述的高精度Winkler技術(shù)。
<0.6-μm過(guò)濾樣品中的呼吸趨勢-離散O2或CO2測量用于估計呼吸的一個(gè)主要缺點(diǎn)是，它們需要較長(cháng)的培養時(shí)間才能觀(guān)察到與初始氧氣濃度的顯著(zhù)差異。 然后假設耗氧量是線(xiàn)性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時(shí)間內驗證。 在之前的一項研究中，Pomeroy等人（1994年）觀(guān)察到在每5小時(shí)進(jìn)行一次離散氧測量的24小時(shí)孵化期間氧濃度時(shí)間過(guò)程的不同趨勢。 他們三分之一的數據沒(méi)有顯示氧濃度隨時(shí)間的線(xiàn)性下降。 因此，他們建議持續監測氧氣濃度，以便更好地估計細菌呼吸。 然后假設耗氧量是線(xiàn)性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時(shí)間內驗證。在之前的一項研究中，Pomeroy等人（1994年）觀(guān)察到在每5小時(shí)進(jìn)行一次離散氧測量的24小時(shí)孵化期間氧濃度時(shí)間過(guò)程的不同趨勢。他們三分之一的數據沒(méi)有顯示氧濃度隨時(shí)間的線(xiàn)性下降。因此，他們建議持續監測氧氣濃度，以便更好地估計細菌呼吸。
氧氣微探針的使用使我們能夠連續跟蹤呼吸瓶中的氧氣濃度。 然后將氧濃度數據與時(shí)間擬合成指數衰減方程，然后根據擬合函數的一階導數計算呼吸的時(shí)間過(guò)程。 同時(shí)，在重復0.6-μm過(guò)濾樣品的24小時(shí)黑暗培養期間，每5小時(shí)測定一次3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細菌豐度。 圖4顯示了兩種對比營(yíng)養狀態(tài)下（M10，貧營(yíng)養狀態(tài)，D01，富營(yíng)養狀態(tài)，見(jiàn)圖1）的呼吸、細菌豐度和細菌產(chǎn)生的時(shí)間過(guò)程。
圖4. 來(lái)自富營(yíng)養化D01（a）和貧營(yíng)養化場(chǎng)地M10（B）的0.6μm濾液的細菌豐度（?）、TdR摻入（）和呼吸（-）。 條形代表標準偏差。
在富營(yíng)養化現場(chǎng)樣品中，顯著(zhù)的呼吸僅在2至3小時(shí)后出現（圖4A），而在貧營(yíng)養現場(chǎng)樣品中，僅在8至10小時(shí)后出現（圖4B）。
在D01（圖4A）中，TdR摻入率顯著(zhù)增加，在孵育24小時(shí)內從6 pM h增加到180 pM h–1。 培養結束時(shí)，細菌豐度達到初始值的5倍。 呼吸在培養2小時(shí)后達到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養15小時(shí)后變得幾乎為零。 TdR和細菌豐度的增加表明細菌可能不受資源限制。 觀(guān)察到的生產(chǎn)和消費之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個(gè)過(guò)程之間存在時(shí)間上的不耦合。 培養結束時(shí)，細菌豐度達到初始值的5倍。呼吸在培養2小時(shí)后達到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養15小時(shí)后變得幾乎為零。TdR和細菌豐度的增加表明細菌可能不受資源限制。觀(guān)察到的生產(chǎn)和消費之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個(gè)過(guò)程之間存在時(shí)間上的不耦合。
來(lái)自寡營(yíng)養部位的樣本（圖4B）在數小時(shí)的滯后期后顯示胸腺嘧啶核苷摻入增加。類(lèi)似地，顯著(zhù)呼吸僅在6小時(shí)的滯后期后才可測量，并且速率（0.6μM O2 h–1）在接下來(lái)的15小時(shí)內幾乎保持不變，而胸腺嘧啶核苷摻入率持續增加，直到培養結束時(shí)達到45 pM TdR h–1。在最初的15小時(shí)內，細菌數量增加了2.5倍，并在1.4×106細胞mL–1附近達到一個(gè)平臺。
這些結果允許優(yōu)化培養時(shí)間，以測量貧營(yíng)養和富營(yíng)養場(chǎng)所異養細菌的耗氧量。此外，3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細菌豐度的平行趨勢證明了該方法的局限性。事實(shí)上，應謹慎解釋結果，考慮到測量結果更能代表瓶?jì)扰囵B過(guò)程中發(fā)生的過(guò)程，而不是初始原位條件。
M10站的結果表明，只有當細菌數量和活性增加時(shí)，才能觀(guān)察到顯著(zhù)的耗氧量。這種活性的增加可能是由于>0.6μm生物體的捕食釋放、過(guò)濾過(guò)程中脆弱細胞的破壞、玻璃材料上有機物的瓶效應吸附和濃縮，或培養過(guò)程中細菌群落的變化（Sch?fer等人，2000年；Massana等人，2001年；Fuchs等人，2000年；Gattuso等人，2002年）。Biddanda等人（1994年）已經(jīng)表明，在墨西哥灣北部不同營(yíng)養狀態(tài)的水域中培養期間，細菌的豐度和活性都會(huì )增加。在他們的研究中，在培養20小時(shí)后，高產(chǎn)陸架水域和低產(chǎn)坡水域的細菌產(chǎn)量分別增加了12倍和8倍。Likew在ise中，富營(yíng)養化場(chǎng)所的細菌豐度增加了1.5倍，而貧營(yíng)養場(chǎng)所的細菌豐度保持不變。因此，在這些孵化過(guò)程中，群落的進(jìn)化和活性測量并不能真正代表初始條件。
因此，最好在最短的時(shí)間內培養，以保持最接近初始條件。因此，我們選擇以5小時(shí)間隔計算的斜率來(lái)測量細菌呼吸。這一時(shí)間是確保氧氣濃度顯著(zhù)降低的最短時(shí)間和最小值之間的最佳折衷時(shí)間增加細菌DNA合成率（1.19±0.21倍）和豐度（1.42±0.09倍）。當我們觀(guān)察到氧氣顯著(zhù)減少時(shí)，選擇間隔的開(kāi)始。
連續O2測量與離散O2測量我們從16個(gè)營(yíng)養狀態(tài)對比的站點(diǎn)共收集了27個(gè)樣本（表1）圖5顯示了我們研究期間觀(guān)察到的氧濃度的不同時(shí)間過(guò)程。圖6顯示了估算細菌呼吸的離散方法和連續方法之間的比較。
圖5.氧氣濃度和預測呼吸隨時(shí)間變化的不同趨勢表示。n表示我們研究期間觀(guān)察到的相應病例數。兩條線(xiàn)表示間隔（5小時(shí)）用于計算細菌呼吸。對于b型和c型，起始點(diǎn)從最小減少0.5μM O2開(kāi)始設置（見(jiàn)正文）。
表1.在整個(gè)水柱上取樣的站的平均特征
27例中只有9例在孵化期間表現出恒定的O2消耗（模型a，圖5和圖6）因此，在計算細菌呼吸時(shí)沒(méi)有顯示出重要的偏差。在模型a中，估計細菌呼吸的離散方法將給出與通過(guò)連續監測氧氣濃度所估計的結果相似的結果。該模型表征了顯示低凈細菌產(chǎn)量的水樣的呼吸（圖7）。
圖6.通過(guò)離散和連續O2測量估計的呼吸比較。對于離散方法，呼吸是根據孵化開(kāi)始和結束時(shí)（14小時(shí)或24小時(shí)）的氧氣濃度之間的差異計算的。
圖7.培養過(guò)程中觀(guān)察到的平均凈細菌生物量的分布，作為耗氧量模型的函數。誤差條表示標準偏差。
模型b在氧氣減少之前呈現5到10小時(shí)的滯后階段。一般來(lái)說(shuō)，該模型是開(kāi)放瀉湖樣帶（圖1）中寡營(yíng)養樣品（7個(gè)樣品中的4個(gè)）的特征。在模型b中，通過(guò)離散方法估計的呼吸將導致氧消耗率的低估（圖6）。正如模型a所觀(guān)察到的，模型b是水樣的特征，表現出較低的凈細菌產(chǎn)量（圖7）。在模型c中，由于生物量和產(chǎn)量的增加，消耗量隨著(zhù)時(shí)間的推移而增加。因此，與5小時(shí)時(shí)間間隔內的連續氧氣記錄相比，離散方法會(huì )高估BR（圖6）。根據模型c呼吸的樣本的特征是細菌凈產(chǎn)量最高（圖7）。最后，在模型d中，斜率在孵化開(kāi)始時(shí)最大，隨后減小。這種趨勢是富營(yíng)養化場(chǎng)所的特征，可能是由于營(yíng)養資源的枯竭和隨后異養細菌活性的降低。對于模型d，用于估計細菌呼吸的離散方法將導致比使用連續監測確定的值更低的速率（圖6）。
這些不同的模型顯示了氧動(dòng)力學(xué)的巨大可變性，因此難以選擇如何計算細菌耗氧量。同樣，在之前的一項研究中，Pomeroy等人（1994年）從24小時(shí)培養期間進(jìn)行的離散氧測量中觀(guān)察到4種不同的氧趨勢。即使在我們的研究中，模型a/b和c/d可以分配給不同營(yíng)養狀態(tài)的水，如細菌生物量?jì)舢a(chǎn)量所示（圖7），我們也不能將一個(gè)模型分配給任何特征點(diǎn)。這一結果強調了需要持續監測浮游微生物的耗氧量，以便以最小偏差評估呼吸速率。
圖8. 用細菌凈生物量（bgebpnet）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測定的細菌產(chǎn)量估算的BGE之間的關(guān)系。
BGE-BGE的估計通常通過(guò)細菌呼吸計算的細菌產(chǎn)量（用3H亮氨酸或3H胸腺嘧啶核苷摻入測量）的替代物來(lái)確定。在我們的研究中，我們根據培養過(guò)程中觀(guān)察到的用于細菌呼吸測定的豐度變化來(lái)估算凈細菌生物量（見(jiàn)材料和程序）。這樣，控制BGE的兩個(gè)進(jìn)程在相同的條件下確定。圖8顯示了用凈細菌生物量產(chǎn)量（BGEBNET）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測定的細菌產(chǎn)量估算的BGE之間的關(guān)系。除了一個(gè)站點(diǎn)外，bgebpnet始終高于BGEBP?？墒褂镁€(xiàn)性回歸（R2=0.75，n=24，P<0.001）將BGEBnet和BGEBP與以下等式關(guān)聯(lián)：
這一趨勢表明，當根據示蹤物摻入估算的細菌產(chǎn)量估算BGE時(shí)，將導致低估細菌生長(cháng)效率。這一低估可能是由于確定兩個(gè)過(guò)程的培養時(shí)間存在差異（TdR衍生細菌生產(chǎn)為1小時(shí)，細菌凈生物量生產(chǎn)為12至24小時(shí)）。
用于估計BGE的24小時(shí)培養可導致生物量和細菌產(chǎn)量的強烈變化，如圖4所示。細菌生物量和產(chǎn)量的這些變化會(huì )強烈影響B(tài)GE的測定。圖9顯示了根據圖4所示數據計算的24小時(shí)孵育期間BGE的時(shí)間過(guò)程。在富營(yíng)養化現場(chǎng)（D01），BGE在孵化開(kāi)始時(shí)等于7%，并且隨著(zhù)時(shí)間的推移而強烈增加，在孵化20小時(shí)后達到53%的最大值。BGE的增加是由于孵化期間呼吸速率的強烈下降，伴隨著(zhù)恒定的凈生物量細菌產(chǎn)量（圖4A）。Coffin等人（1993年）觀(guān)察到24小時(shí)培養期間細菌豐度和呼吸的類(lèi)似模式，導致BGE有規律地增加。類(lèi)似地，Pomeroy等人（1994年）觀(guān)察到氧呼吸減少（使用多點(diǎn)Winkler滴定法）伴隨著(zhù)由亮氨酸摻入確定的細菌產(chǎn)量的規律性增加。這些觀(guān)察到的兩個(gè)過(guò)程的時(shí)間過(guò)程導致在孵化期間BGE有規律地增加。高初始呼吸速率伴隨著(zhù)低細菌產(chǎn)量（導致低BGE值）可能表明這兩個(gè)過(guò)程并不像del Giorgio和Cole（1998）之前所建議的那樣耦合。
圖9. 在兩種對比營(yíng)養狀態(tài)下，BGE在24小時(shí)孵化期間的時(shí)間過(guò)程。 用于計算BGE的數據來(lái)自圖4。 對于M10站，在10小時(shí)間隔內計算凈生物量產(chǎn)量，以獲得細菌豐度的顯著(zhù)變化。 在兩種對比營(yíng)養狀態(tài)下，BGE在24小時(shí)孵化期間的時(shí)間過(guò)程。用于計算BGE的數據來(lái)自圖4。對于M10站，在10小時(shí)間隔內計算凈生物量產(chǎn)量，以獲得細菌豐度的顯著(zhù)變化。
相反，在寡營(yíng)養站點(diǎn)M10，呼吸作用和細菌凈生物量的產(chǎn)生隨時(shí)間保持不變（圖4B）。 因此，BGE在孵化期間沒(méi)有表現出顯著(zhù)的變化（圖9）。 24小時(shí)培養期間BGE的可能變化，如在富營(yíng)養化現場(chǎng)觀(guān)察到的變化，強調有必要盡可能縮短培養時(shí)間，以盡量減少BGE測定中的偏差。 因此，BGE在孵化期間沒(méi)有表現出顯著(zhù)的變化（圖9）。24小時(shí)培養期間BGE的可能變化，如在富營(yíng)養化現場(chǎng)觀(guān)察到的變化，強調有必要盡可能縮短培養時(shí)間，以盡量減少BGE測定中的偏差。
使用氧微電極來(lái)研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長(cháng)速率——摘要
使用氧微電極來(lái)研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長(cháng)速率——材料和程序
