奶牛乳腺炎屬于奶牛的一種常見(jiàn)疾病，是制約奶牛健康養殖發(fā)展的重要因素，給奶牛養殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。人畜共患的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一。近年來(lái)抗生素在養殖業(yè)中的濫用加劇了金黃色葡萄球菌耐藥菌株的出現和流行，這給奶牛乳腺炎的預防治療增加了難度和成本，同時(shí)病原菌和抗生素對奶產(chǎn)品與環(huán)境的污染嚴重威脅了公共衛生安全。研究金黃色葡萄球菌的耐藥機制和環(huán)境適應機制對指導抗生素在治療奶牛乳腺炎中的合理使用、遏制耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。本試驗利用基因編輯技術(shù)、細胞培養技術(shù)、TEM、q RT-PCR和全基因組測序技術(shù)等，對奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行了檢測和功能分析，并且對在本實(shí)驗中發(fā)現的一種新的細菌表型異質(zhì)亞群進(jìn)行了表型檢測和表型異質(zhì)產(chǎn)生機制的探究，揭示了金黃色葡萄球菌耐藥相關(guān)基因與菌群表型異質(zhì)性對細菌群體抗生素耐藥性和環(huán)境適應能力的影響。

主要研究結果如下:

(1)奶牛乳腺炎源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐藥相關(guān)基因的檢測與分析。以奶牛乳腺炎來(lái)源的MRSA菌株BA01611為研究對象，參考實(shí)驗室前期的BA01611在苯唑西林抗生素處理下的RNA-seq數據，選擇了15個(gè)表達水平受抗生素影響且在金黃色葡萄球菌中缺乏研究的基因，構建基因敲除質(zhì)粒，最后成功獲得了9株BA01611基因敲除菌株。通過(guò)對這9株菌以及實(shí)驗室前期已構建完成的7株BA01611基因敲除菌株進(jìn)行抗生素耐藥性檢測，最終發(fā)現了13個(gè)與奶牛乳腺炎源MRSA抗生素耐藥性相關(guān)的基因，包括1個(gè)與抗生素抗性成負相關(guān)的基因和12個(gè)呈正相關(guān)的基因，其中有3個(gè)基因的敲除嚴重降低了BA01611菌株的抗生素耐藥性，它們分別為:屬于Lyt R-Cps A-Psr家族的編碼磷酸轉移酶的基因lcpA、屬于Lys R家族的編碼谷氨酸鹽合酶轉錄激活因子的基因glt C和屬于Mar R家族的轉錄調控因子SAV0686。

(2)磷酸轉移酶基因lcpA對不同金黃色葡萄球菌抗生素耐藥性和細胞黏附等生物學(xué)特性影響的研究，以及表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC的分離。本試驗構建了金黃色葡萄球菌菌株Mu50和Newman的lcpA敲除菌株，并從Mu50的lcpA敲除菌株中分離出一種新的耐藥性增強且能形成大菌落的表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC。通過(guò)檢測細菌抗生素耐藥性發(fā)現lcpA對抗生素耐藥性的影響存在菌株特異性:敲除lcpA顯著(zhù)降低了BA01611和Newman對大部分靶向細胞壁和核糖體抗生素的抗性;敲除lcpA不影響Mu50對多數靶向細胞壁抗生素的抗性，但降低了其對靶向核糖體抗生素的耐藥性;敲除lcpA增強了表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC對靶向細胞壁抗生素的耐藥性，但不影響其對靶向核糖體抗生素的耐藥性。此外，通過(guò)各項檢測試驗發(fā)現lcpA對金黃色葡萄球菌其它生物學(xué)特性也具有菌株特異性的影響:對于BA01611，敲除lcpA降低了黏附宿主細胞和菌體抗裂解能力，但增強了生物膜的形成和誘導宿主細胞炎癥因子表達的能力，而對其菌黃素合成和菌落擴散沒(méi)有顯著(zhù)影響;對于Mu50，敲除lcpA對其黏附宿主細胞、菌體抗裂解、菌落擴散和生物膜形成影響不顯著(zhù)，但能降低其菌黃素的合成，增強其誘導宿主細胞炎癥因子表達的能力。以上結果表明:lcpA對金黃色葡萄球菌耐藥性具有重要作用，但對Mu50具有菌株特異性影響，lcpA對細菌致病性的影響比較復雜;Mu50△lcpA菌株可以通過(guò)在細菌群體內產(chǎn)生表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC來(lái)增強群體對抗生素的抵抗能力。

(3)金黃色葡萄球菌表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC的表型檢測及其表型異質(zhì)產(chǎn)生機制的探究。利用TEM等方法對Mu50△lcpA-LC表型進(jìn)行全面分析，結果顯示:Mu50△lcpA-LC的菌黃素合成水平降低、細胞體積增大，菌落擴散能力增強，生物膜形成能力減弱，在平板上形成表型可逆的淡黃色大菌落。通過(guò)與宿主細胞共孵育發(fā)現Mu50△lcpA-LC具有更強的宿主細胞黏附能力和刺激宿主細胞免疫因子表達的能力。利用q RT-PCR和全基因組測序等技術(shù)對細菌碳源代謝水平進(jìn)行檢測和基因組序列比對分析，發(fā)現Mu50△lcpA-LC通過(guò)上調acs A等基因的表達水平加速細菌在對數期對乙酸鹽的代謝利用，從而下調cid等基因的表達，抑制對數期菌體細胞壁的水解和平臺期細胞的裂解，同時(shí)，Mu50△lcpA-LC三羧酸循環(huán)顯著(zhù)增強，細菌蛋白表達和分泌模式發(fā)生顯著(zhù)改變，此外，Mu50△lcpA-LC的編碼蛋白A的基因spa表達被激活，這可能幫助細菌逃避機體免疫。Mu50△lcpA-LC碳源代謝水平的變化可能與其表型異質(zhì)有關(guān)。Mu50△lcpA-LC表型異質(zhì)的發(fā)生可能與其碳源代謝水平發(fā)生變化有關(guān)。

以上結果表明:Mu50△lcpA可以不依賴(lài)基因序列的變化和環(huán)境改變，在群體內部通過(guò)調控碳源代謝產(chǎn)生具有耐藥和高擴散能力等表型優(yōu)勢的表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC，從而增強細菌群體對環(huán)境的適應能力。綜上所述，本試驗在奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌中篩選出了13個(gè)的耐藥相關(guān)基因，全面分析了磷酸轉移酶基因lcpA在不同流行菌株中的功能差異，揭示了lcpA功能的菌株特異性。同時(shí)，本試驗在Mu50△lcpA菌株群體內發(fā)現了一種新的耐藥表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC，通過(guò)對表型異質(zhì)亞群的菌群擴散能力、抗生素耐藥性和細胞黏附等表型變化的詳細闡述，以及對其表型異質(zhì)產(chǎn)生機制的探究，揭示了菌群內表型異質(zhì)性對金黃色葡萄球菌應對環(huán)境壓力的重要作用。本研究豐富了我們對金黃色葡萄球菌環(huán)境適應能力的認識，為后續MRSA耐藥性研究提供了材料資源和理論基礎，為治療由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎提供理論依據。