生物獲取營(yíng)養首先需要識別并傳感到營(yíng)養才可能根據自身對營(yíng)養的需求情況吸收相應的營(yíng)養。植物要平衡、調節其體內的營(yíng)養，必須建立有效的傳感系統，用來(lái)迅速傳感各個(gè)營(yíng)養素在根際土壤中是否存在及其濃度的信息，以應對土壤中可利用的養分在時(shí)間和空間上的劇烈波動(dòng)。氮是植物生長(cháng)最重要的元素，尿素CO(NH2)2是全球最常用的氮肥。尿素不僅相對含氮量高，而且是植物體內精氨酸循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，對植物體內的氮素循環(huán)和碳氮平衡起到重要作用。

高等植物對無(wú)機氮(銨態(tài)氮、硝態(tài)氮)和有機氮的傳感吸收能力各有不同，現有的研究表明，大多數植物都存在對不同種類(lèi)氮源的低親和力和高親和力2種傳感轉運系統。迄今為止，對于氮源傳感和吸收的研究主要集中在植物體內硝酸根離子轉運系統和銨根離子轉運系統，但對尿素傳感、吸收和轉運系統的鑒定和相關(guān)功能的研究還停留在尿素也可以作為植物快速吸收利用的氮源階段。雖然已發(fā)現了2類(lèi)轉運尿素的膜蛋白，即MIPs和DUR3，它們分別在低親和力、高親和力尿素吸收和運輸中發(fā)揮作用，但是其確切的傳感受體和機制仍需進(jìn)一步的研究。

尿素的大量施用雖有助于農作物提高產(chǎn)量，但是由于植物對氮的利用效率并不清楚，這種做法會(huì )因為氮營(yíng)養過(guò)剩而嚴重危害環(huán)境。尋找適合植物的最佳施肥量，需要深入了解不同植物根系傳感和吸收營(yíng)養的動(dòng)力學(xué)規律。植物根系對養分的傳感能力始終受到科學(xué)家的關(guān)注，現有的研究方法多為通過(guò)同位素標記檢測其相關(guān)的吸收動(dòng)力學(xué)或是異源表達相關(guān)基因驗證其效果，但根系對營(yíng)養的傳感能力應遠高于其吸收能力，而生物必須先傳感到營(yíng)養才可以進(jìn)一步吸收利用。本課題組經(jīng)過(guò)多年研究，已經(jīng)成功構建了動(dòng)物受體傳感器和動(dòng)物組織傳感器，并進(jìn)行了相關(guān)物質(zhì)的傳感動(dòng)力學(xué)研究。目前在植物組織或植物受體傳感器的研究方面尚未見(jiàn)報道，如果能夠成功構建植物根分生組織和受體傳感器，并對相應的營(yíng)養物配體進(jìn)行傳感動(dòng)力學(xué)研究，一方面有助于解決當下過(guò)度施肥引起的土壤板結和水環(huán)境污染;另一方面有助于進(jìn)一步采用生物技術(shù)方法提高植物氮素利用效率。該傳感器的成功構建可為植物根系營(yíng)養傳感及其吸收和調節機制研究、農業(yè)精準施肥提供一種新的研究方法。

本研究選擇玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜4種植物的根尖分生組織組裝傳感器，定量化測定傳感配體——尿素。通過(guò)電化學(xué)工作站和時(shí)間—電流曲線(xiàn)法測定尿素與玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜根尖分生組織相互作用所產(chǎn)生的配體—受體識別和聯(lián)動(dòng)變構所產(chǎn)生的電化學(xué)信號，得到4種植物根尖對尿素的傳感范圍和相應的動(dòng)力學(xué)參數，并通過(guò)相應的培養實(shí)驗驗證其真實(shí)的生物學(xué)作用。

1材料與方法

1.1材料與試劑

玉米(Zea mays L.)、辣椒(Capsicum annuumL.苗、花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis L.)、黃瓜(Cucumissativus L.)苗各10株?？扇苄缘矸?、無(wú)水CaCl2、尿素等均購自天津市贏(yíng)達稀貴化學(xué)試劑廠(chǎng)(中國)。海藻酸鈉來(lái)自天津光復精細化工研究所(中國)。所有其他化學(xué)品均為分析純。去離子水來(lái)自Millipore公司的Milli-Q純水系統(Elix Essential 5，美國)，并被用在所有的實(shí)驗中。

CHI660E型電化學(xué)工作站購自上海辰華儀器有限公司(中國上海);核微孔膜(孔徑0.22μm，周長(cháng)25 mm)購自Whatman公司(英國)。

1.2電極預處理與效果表征

將玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE)用不同粒徑的α-Al2O3漿(1.00、0.30、0.05μm)在麂皮上拋光，每次拋光后在超聲波水浴中清洗30 s，重復2~3次，然后用超純水清洗玻碳電極。在1 mol·L-1 H2SO4溶液中使用循環(huán)伏安法對玻碳電極進(jìn)行活化，活化時(shí)電壓的掃描范圍是-1.0~1.0 V、掃描速率是100 mV·s-1，重復掃描直至出現穩定的循環(huán)伏安曲線(xiàn)圖。

將活化的玻碳電極置于1×10-3 mol·L-1 K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol·L-1 KNO3)中對其進(jìn)行循環(huán)伏安曲線(xiàn)掃描，電壓的掃描范圍為-0.1~0.6 V，掃描速度為50 mV·s-1。同時(shí)，使用交流阻抗法表征電子傳遞到電極表面所受到的阻抗大小，以達到間接表征電極預處理后的界面情況。最后置于氮氣環(huán)境中干燥待用。

1.3電化學(xué)生物傳感器的制備

溶液配置:①1%的可溶性淀粉溶液:稱(chēng)取1 g可溶性淀粉溶于99 mL超純水中，之后加入1 mL 10%的戊二醛，80℃水浴攪拌加熱30 min。室溫條件下放置過(guò)夜。②2%的海藻酸鈉溶液:稱(chēng)取2 g海藻酸鈉溶于100 mL超純水中，攪拌過(guò)夜。③5%的CaCl2溶液:稱(chēng)取5 g CaCl2溶于100 mL超純水中。④將1%的可溶性淀粉溶液與2%的海藻酸鈉溶液以體積比1:1混勻在平皿中，另取一平皿吸取等體積的5%的CaCl2溶液。

固定化植物組織傳感器組裝:將新鮮的根尖分生組織用超純水清洗干凈，在細胞培養皿中用手術(shù)刀切碎，過(guò)程中保持根尖濕潤，立即儲藏在4℃冰箱中備用。

將準備好的0.25 cm2的植物根尖分生組織放置于一張直徑為25 mm、孔徑為0.22μm的核微孔膜的圓心上，然后覆蓋另一張，迅速將1號培養皿中的混合液均勻涂抹在核微孔膜邊緣，再將其邊緣浸沒(méi)在2號培養皿中，使得海藻酸鈉與CaCl2完全交聯(lián)，得到穩定的螯合物，然后用超純水沖洗組裝好的植物根尖分生組織測定膜，沖洗掉殘留在膜上的Cl-、Ca2+等離子，最后將組裝好的植物根尖分生組織測定膜用皮筋固定在玻碳電極上，植物根尖分生組織要完全覆蓋電極極芯，再用超純水沖淋電極制成生物傳感器(圖1)。

圖1植物根尖分生組織傳感器測定原理圖

1.4電化學(xué)生物傳感器對植物根尖分生組織的測定方法

采用三電極系統，以固定好的“三明治”式植物根尖分生組織膜的玻碳電極作為工作電極，以Ag/AgCl電極作為參比電極，以鉑絲電極作為對電極，以超純水作空白對照，在一定的電壓下通過(guò)電流—時(shí)間測定法測定尿素溶液與植物根尖分生組織作用的響應電流值，以響應電流的變化率作為檢測指標，每個(gè)濃度平行測定3次。按公式(1)計算響應電流的變化率ΔI。

式(1)中:I1表示空白對照的響應電流值/A，I2表示待測定尿素溶液的響應電流值/A。