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討論
已播種的釀酒葡萄漿果的中果皮通常顯示出一種與成熟后期脫水和風(fēng)味發(fā)展相關(guān)的程序性CD（Tilbrook和Tyerman，2008年；Fuentes等人，2010年；Bonada等人，2013年b）。在這里，我們展示了漿果中果皮和[O的CD模式之間的密切相似性，其中中果皮2]剖面的中心區域具有最高的CD和最低的[O 2]。在設拉子和霞多麗中，中果皮中心的缺氧量隨著(zhù)成熟和CD的進(jìn)展而增加，在我們的實(shí)驗條件下，開(kāi)花后約100天基本上變得缺氧。這與無(wú)籽鮮食葡萄品種形成對比，后者的[O 2]保持在~15μmol l-1在中果皮中部(1.1 kPa)以上，仍被認為是缺氧的（Saglio等人，1988年），其中CD不太明顯。然而，在我們的實(shí)驗系統中，僅測試了三個(gè)品種，并且在具有不同水和糖動(dòng)態(tài)的品種類(lèi)型（葡萄酒與餐桌）存在混雜效應（Sadras等，2008之間以及種子和無(wú)種子類(lèi)型之間）。分離這些影響需要對有種子和無(wú)種子等基因系進(jìn)行比較。盡管如此，CD和[O之間的強相關(guān)性2]剖面、皮孔的作用、種子呼吸、乙醇發(fā)酵和CT圖像都匯聚在一起，支持我們的工作假設，即中果皮中的缺氧有助于葡萄漿果中的CD。
的最小值[O 2我們在霞多麗和設拉子漿果的果皮中測得]（接近于零）可能等于或低于的K m細胞色素c氧化酶(0.14μM)（Millar等人，1994年），并且很可能導致氧化磷酸化受限并轉向發(fā)酵，如在霞多麗漿果中檢測到乙醇所證明的那樣；測試其他品種的乙醇生產(chǎn)會(huì )很有趣。所有需氧生物都需要O 2才能通過(guò)氧化磷酸化有效地產(chǎn)生ATP。當細胞從氧化磷酸化轉變?yōu)榘l(fā)酵時(shí)，在缺氧條件下產(chǎn)生較低的ATP（Ricard等，1994；Drew，1997；Geigenberger，2003）。ATP的消耗對細胞生理學(xué)產(chǎn)生深遠的影響，包括能量消耗和細胞代謝的變化（Drew，1997年；Bailey-Serres和Chang，2005年）。導致梨褐變障礙的膜完整性喪失也與內部缺氧和低ATP水平有關(guān)（Saquet等人，2003年；Franck等人，2007年）。
葡萄漿果線(xiàn)粒體在強加厭氧條件下的存活（基于琥珀酸氧化率）取決于品種，存活時(shí)間為1天到10天（Romieu等，1992）。這項工作基于碳浸漬過(guò)程，這是一種釀酒過(guò)程，其中整個(gè)漿果在壓碎前在厭氧氣氛中發(fā)酵。乙醇會(huì )改變葡萄線(xiàn)粒體的呼吸商并解耦氧化磷酸化（Romieu等人，1992年）。這些影響發(fā)生在>1%（體積）的乙醇中，遠高于我們在霞多麗漿果中測量的濃度（0.015%）；然而，在我們的案例中，漿果中可能存在局部高濃度的乙醇。在后來(lái)的一項研究中，發(fā)現在厭氧處理前田間種植的霞多麗漿果中的ADH活性和ADH RNA已經(jīng)很高，這表明由于田間的一些壓力條件，葡萄中已經(jīng)存在缺氧情況（Tesnière等人。，1993）。我們的結果表明，這可能是漿果中果皮內某些區域的常態(tài)，并且可能會(huì )因高溫而加?。ㄒ?jiàn)下文）。
的內部[O 2水果]取決于呼吸需求，以及的O 2皮膚和內部組織擴散特性。這些可以顯示基因型差異，就像蘋(píng)果果實(shí)的情況一樣（Ho等人，2010年）。在梨果實(shí)中，皮層的孔隙率、細胞間隙的連通性和細胞分布的差異可能解釋了栽培品種之間的差異（Ho et al.,2009）。對于梨，可以使用氣體擴散的微觀(guān)模型將觀(guān)察到的氣體擴散變化與組織的不規則微觀(guān)結構相協(xié)調。通過(guò)顯微CT評估的不同蘋(píng)果栽培品種似乎也是這種情況（Mendoza等人，2007年）。對于葡萄漿果，的[O 2我們研究中]分布表明O非常低2皮膚的擴散率，因為整個(gè)皮膚發(fā)生了陡峭的梯度。蘋(píng)果皮也表現出非常低的O 2擴散率，同樣在整個(gè)皮膚上有一個(gè)陡峭的濃度梯度（Ho et al.,2010）。由于亞表皮[O 2所有三個(gè)葡萄品種在成熟過(guò)程中葡萄漿果的]急劇下降，這表明中O下降，2成熟過(guò)程擴散率這可能是由于相同的表皮和角質(zhì)層結構變化導致漿果蒸騰作用下降(Rogiers et al.,2004)。
果皮、漿果孔隙度和花梗中皮孔特性的變化都可能導致內部[O的減少2成熟過(guò)程中葡萄漿果]。果實(shí)薄壁組織可以看作是一種多孔介質(zhì)，在橢圓形鑲嵌的細胞之間分布有空氣空間（Gray等，1999；Mebatsion等，2006；Herremans等，2015）。最大[O 2在整個(gè)漿果發(fā)育過(guò)程中，有核漿果和無(wú)核漿果的中心軸區域的]表明存在連接O源的通道2攝入和中央維管束。使用不同的方法，包括用硅脂堵塞花梗皮孔或施加N 2在花梗上，我們的實(shí)驗證明花梗皮孔是O中的主要途徑2擴散到葡萄漿果。這對應于從容器到漿果中心軸的顯微CT中觀(guān)察到的主要氣道。用于研究水果中空氣空間分布的微CT可以揭示影響氣體擴散的重要特性（Mendoza等人，2010年；Herremans等人，2015年）以及內部障礙（Lammertyn等人，2003年）。在我們的工作中，連接花梗與種子周?chē)仪坏目諝饪臻g的可視化提供了[O測量峰的結構聯(lián)系2與漿果中央血管區域周?chē)鷀中。這也證實(shí)了的潛在O 2通過(guò)花梗皮孔和通過(guò)血管網(wǎng)絡(luò )分布吸收途徑。相對較高的[O 2中央和外周維管束周?chē)鷀可能對于維持漿果中韌皮部的卸載很重要，有趣的是，即使漿果中出現嚴重的CD，維管束通常仍然具有生命力（Fuentes 2017年等人，）。，2010年）。盡管如此，我們還是觀(guān)察到在缺氧漿果中的糖濃度更高，這些漿果的皮孔被覆蓋，而它們仍在藤蔓上。這種異?？赡苁怯捎谌毖鯇е滤魅霚p少，從而導致糖濃度增加。缺氧與質(zhì)膜透水性降低有關(guān)(Zhang and Tyerman,1991質(zhì)膜內在蛋白(PIP)家族的水通道關(guān)閉引起的)(Tournaire-Roux et al.,2003)。這是由于在缺氧條件下對降低的細胞質(zhì)pH值敏感。的PIP水通道蛋白基因(預測VvPIP2;1在成熟漿果中高度表達)（Choat等人，2009年）在缺氧條件下會(huì )降低水滲透（Tournaire-Roux等人，2003年），這可能解釋了對霞多麗和設拉子始終觀(guān)察到的整個(gè)漿果水導率下降（Tilbrook和Tyerman，2009年；Scharwies和Tyerman，2017年）。
皮孔是由產(chǎn)生的多細胞結構，在二次生長(cháng)后取代氣孔（腐生菌Lendzian，2006）。與莖周皮相比，皮孔對氣體和水滲透的影響已經(jīng)對一些物種進(jìn)行了測量。對于Betula pendula，皮孔的存在使周皮的透水性顯著(zhù)增加了26到53倍（Sch?nherr和Ziegler，1980）。漿果花梗上的皮孔是沉水分離漿果吸水的優(yōu)先位置（Becker et al.,2012）。水蒸氣和O 2有和無(wú)皮孔樹(shù)皮的滲透率表明，皮孔對O 2滲透率的增加遠大于對水的滲透率，一種樹(shù)種增加了1000倍以上，但對水蒸氣的滲透率高于O 2(Groh等人，2002年）。有趣的是，Sch?nherr和Ziegler(1980)表明，隨著(zhù)水蒸氣活度下降（增加蒸氣壓虧缺），透水性大大降低。如果水蒸氣活性下降也降低O 2的了葡萄漿果皮孔中滲透性，這可能會(huì )限制O 2在呼吸需求增加的情況下擴散，即在水壓力和高溫和蒸氣壓不足的情況下。
[O的減少2在發(fā)育過(guò)程中，已播種的Chardonnay漿果在近似中心軸處]表明呼吸需求可能增加，吸收的O 2通過(guò)花梗皮孔減少，或通過(guò)中央近端的孔隙率減少軸。另一方面，紅寶石無(wú)核漿果沒(méi)有表現出這種減少。這表明有籽釀酒葡萄品種和無(wú)籽鮮食葡萄之間的皮孔結構可能存在差異，或者種子本身成為顯著(zhù)的O 2匯（根據下面提出的論點(diǎn)不太可能）。設拉子較低的皮孔表面積可能表明對O限制更大2與霞多麗相比，擴散的。眾所周知，設拉子在溫暖條件下更早、更快速地增加CD（Fuentes等人，2010年；Bonada等人，2013年a）。不幸的是，，我們無(wú)法探測[O 2由于無(wú)法可視化相對于設拉子漿果中傳感器的種子位置設拉子漿果中心區域的]以與霞多麗進(jìn)行比較?；üＦた自谧屍咸褲{果“呼吸”方面的作用以及它們在不同品種之間的差異似乎被忽視了，而且在水果中似乎是獨一無(wú)二的。簇的緊密度和花梗長(cháng)度也可能影響通過(guò)該通道的氣體擴散，最終導致整個(gè)成熟過(guò)程中漿果內部氧氣可用性的差異。
有籽和無(wú)籽栽培品種之間氧氣分布差異的另一個(gè)可能解釋是，種子是顯著(zhù)的O 2在成熟后期匯。種子的氧氣供應對于種子生長(cháng)以及蛋白質(zhì)和油的沉積至關(guān)重要（Borisjuk和Rolletschek，2009年）。另一方面，低[O 2種子內的]有利于低水平的ROS，從而防止細胞損傷（Simontacchi等人，1995年）。在早熟期間，有籽釀酒葡萄品種雷司令和巴斯塔多的O 2吸收量從<0.45μmol h–1每個(gè)漿果增加到每個(gè)漿果約3μmol h–1，而無(wú)核Sultana的最大O 2吸收量為1.5μmol h–1每個(gè)漿果（Harris等人，1971年）。我們觀(guān)察到，在成熟開(kāi)始前后，總種子呼吸作用是整個(gè)漿果呼吸作用的一半以上。O這種高2的在外層木質(zhì)化之前，種子對需求（Cadot等人，2006年）可能會(huì )產(chǎn)生顯著(zhù)的O 2在漿果內需求，這可能會(huì )降低細胞[O 2室中的]，并可能降低[O 2]在中果皮中。然而，霞多麗的種子呼吸在成熟后期急劇下降，這是每克漿果呼吸減少的原因。在晚熟期間，[O 2種子栽培品種的中果皮中的]下降到幾乎為零。因此，較低的[O不太可能是2中果皮中]由種子的呼吸需求直接引起的。
溫度升高會(huì )促進(jìn)霞多麗和設拉子漿果的CD發(fā)生并增加CD的發(fā)生率（Bonada等，2013 a）。使用梨果實(shí)的建模方法，結果表明，溫度升高會(huì )大大增加呼吸速率，但不會(huì )影響氣體擴散特性，從而導致預測的核心[O非常低2]（Ho等人，2009年）。我們對漿果中果皮[O直接測量2]剖面的與這一預測一致。我們還觀(guān)察到典型的Q 10和呼吸活化能分別為2.47和2.27，在10°C和40°C之間，Chardonnay和Shiraz漿果的整個(gè)漿果呼吸速率分別為呼吸?；罨芘c報道的相似Hertog等人。(1998)對于蘋(píng)果(52 875 J mol–1)、菊苣(67 139 J mol–1)和番茄(67 338 J mol–1)。與梨果實(shí)不同，釀酒葡萄漿果在植物上成熟，并且會(huì )變得比周?chē)諝鉄岬枚啵⊿mart和Sinclair，1976年；Tarara等人，2008年；Caravia等人，2016年）。瞬態(tài)高溫會(huì )產(chǎn)生大量的呼吸需求和低[O 2正如我們觀(guān)察到的那樣，在中果皮的中心]。然而，隨后的在夜間或較溫和的天氣時(shí)的冷卻會(huì )降低呼吸需求和增加內部〔O 2]如果擴散代表O 2保持相同。這可能會(huì )導致產(chǎn)生破壞性的ROS，從而導致不可恢復的細胞損傷（Pfister-Sieber和Braendle，1994年；Ravyler等人，2002年）。
結論
葡萄內部[O 2]在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中下降，并且與中果皮細胞死亡的特征相關(guān)?；üＩ系钠た诪镺提供了途徑2擴散到漿果中，當被覆蓋以限制O 2擴散到漿果中時(shí)，會(huì )導致漿果[O大量減少2中心的]，乙醇濃度增加，以及細胞死亡。不同內部O 2品種之間漿果可用性的差異可能與種子發(fā)育和皮孔表面積的差異有關(guān)。這里提供的數據為進(jìn)一步研究漿果氣體交換在漿果質(zhì)量和栽培品種選擇中的作用提供了基礎，以適應氣候變暖的葡萄栽培。
補充資料
補充數據可在JXB在線(xiàn)獲得。
圖S1。漿果呼吸速率的溫度依賴(lài)性。
圖S2。呼吸Q 10 Chardonnay和Shiraz漿果的在兩個(gè)成熟階段對短期測量溫度的響應。
圖S3。兩個(gè)發(fā)育階段霞多麗漿果空氣空間的顯微CT分析。
致謝
我們感謝Wendy Sullivan的專(zhuān)家技術(shù)援助，以及Adelaide Microscopy的設施和技術(shù)支持。這項研究由澳大利亞研究委員會(huì )(ARC)創(chuàng )新葡萄酒生產(chǎn)培訓中心(中心www.adelaide.edu.au/tc-iwp/)進(jìn)行，該作為ARC工業(yè)轉型研究計劃（項目編號IC130100005）得到澳大利亞葡萄酒協(xié)會(huì )和行業(yè)合作伙伴的支持。
