研究簡(jiǎn)介:口臭是牙周病的一種特征性癥狀，由硫酸鹽還原菌產(chǎn)生的揮發(fā)性硫化物(VSCs)引起，如硫化氫(H2S)和甲硫醇。重要的是在體外系統中，可培養的主要牙周機會(huì )性病原體牙齦卟啉單胞菌(Pg)、核酸棒狀桿菌(Fn)和連翹炭疽桿菌(Tf)通過(guò)氣相色譜法測量都會(huì )產(chǎn)生H2S。H2S不僅可以由細菌產(chǎn)生，也可以由宿主的代謝系統產(chǎn)生。然而，牙周細菌產(chǎn)生的H2S是否會(huì )影響牙周細菌周?chē)芤褐械腍2S濃度，這一點(diǎn)尚不明確。H2S與心血管和神經(jīng)系統的調節以及炎癥有關(guān)。它通過(guò)特定的酶（如CBS和CSE）自動(dòng)產(chǎn)生，并可能與炎癥反應有關(guān)。牙齦上皮細胞是牙齦縫隙的第一道防線(xiàn)，對宿主的先天性和適應性免疫反應至關(guān)重要。它們通過(guò)產(chǎn)生促炎細胞因子和抗菌肽來(lái)保護宿主免受細菌挑戰。Pg和其他假定的牙周病原體不僅在病變的牙周袋中定植，也會(huì )在健康的牙齦縫隙中定植，但其對健康牙齦上皮細胞的影響尚未得到充分研究。研究推測牙周細菌產(chǎn)生的H2S可能通過(guò)上調牙齦上皮細胞產(chǎn)生的IL-8來(lái)促進(jìn)炎癥反應。本研究的目的是監測不同口腔細菌菌株釋放的H2S濃度，并研究Pg釋放的H2S對牙齦上皮細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子IL-8的影響。

Unisense硫化氫微電極與氫電極應用

細菌在肉湯培養基中培養至對數生長(cháng)后期，然后調節所有菌株的濃度至光密度(OD 590nm)為0.9。然后，將細菌懸浮液在7000rpm轉速下離心15分鐘。上清液立即用針式H2S或H2電極(UnisenseA/S，丹麥)測量硫化氫(H2S)或氫氣(H2)。每次測試時(shí)，都要讓傳感器穩定下來(lái)，并以5秒鐘的間隔取三個(gè)測試點(diǎn)。在肉湯中培養的每種細菌菌株至少要分別進(jìn)行三次H2S和H2的生成檢測。

實(shí)驗結果

IL-8介導的主要生物功能是對中性粒細胞(一種清道夫細胞)的化學(xué)吸引。中性粒細胞會(huì )遷移到上皮細胞釋放IL-8的部位，促進(jìn)細菌的吞噬。一般來(lái)說(shuō)，中性粒細胞釋放的活性氧(ROS)不僅能殺死細菌，還能加劇炎癥。H2S介導的上皮細胞IL-8上調應該會(huì )通過(guò)招募過(guò)多的中性粒細胞來(lái)增強該部位的炎癥。體內研究表明，內源性H2S和外源性H2S都有助于增加中性粒細胞向胰腺、肺和肝臟炎癥誘導區的遷移，這支持了我們的假設，即牙周細菌釋放的H2S也能促進(jìn)中性粒細胞向牙周袋的趨化。首次證明了紅色復合牙周細菌Pg產(chǎn)生的H2S濃度能夠上調牙齦和口腔上皮細胞中誘導的IL-8表達，揭示了可能促進(jìn)牙周疾病炎癥的機制。

圖1、測量口腔細菌釋放的H2S：在厭氧條件下培養屬于不同致病菌群復合體的14種細菌，直到它們達到對數生長(cháng)后期。所有菌株的濃度均調整至0.9(以OD 590nm測量)。使用針式H2S或H2傳感器測量細菌培養液中的H2S和H2濃度。

圖2、外源H2S對OBA9和OKF6細胞IL-8產(chǎn)量的影響：將匯合培養的牙齦上皮細胞系(OBA9)或口腔上皮細胞系(OKF6)暴露于連續稀釋的H2S供體Na2S中24小時(shí)，無(wú)論是否有PMA(1μmolfL)刺激。用酶聯(lián)免疫吸附法測定OBA9(A)或OKF6(B)產(chǎn)生的培養上清中IL-8的濃度。

圖3、Pg W83釋放的可溶性因子(包括H2S)對OBA9和OKF6產(chǎn)生IL-8的影響：圖示為transwell檢測系統(A)。將上皮細胞OBA9或OKF6培養在下腔中，直至其完全覆蓋組織培養孔表面。隨后，將活體或固定的Pg W83與或不與H2S清除劑一起放入上腔。它們在含有炎癥刺激物PMA(1μmol/L)的KSF培養基中共同培養24小時(shí)。用酶聯(lián)免疫吸附法測定OBA9(B,D)或OKF6(C,E)培養上清中IL-8的濃度。

圖4、野生型Pg 33277或Pg KDP137(RGP-KGP-HagA三重缺失突變株)的對數生長(cháng)期培養液使用針型H2S傳感器檢測H2S濃度。數據為三個(gè)培養物的平均值±SD。(B)OBA9細胞在下腔培養，Pg KDP137在有或沒(méi)有嗎啉樹(shù)脂的PMA(1mmol/L)存在下應用于transwell共培養系統的上腔。共培養48小時(shí)后，用ELISA法測定培養上清液中IL-8的濃度。

結論與展望

硫化氫(H2S)是一種揮發(fā)性硫化合物，被認為是導致炎癥的原因之一，尤其是由胃腸道器官中的細菌產(chǎn)生的硫化氫。然而，目前還不清楚牙周病原體產(chǎn)生的H2S是否會(huì )影響口腔/牙齦上皮細胞介導的炎癥反應。因此本論文研究的目的是比較14株口腔細菌體外產(chǎn)生H2S的情況；評估H2S對宿主口腔/牙齦上皮細胞誘導的炎癥反應的影響。Unisense微電極系統被用來(lái)精確測量口腔細菌在培養基中釋放的硫化氫（H2S）濃度。這種微電極能夠檢測溶解在溶液中的小氣體分子，包括H2S和氫氣（H2）。評估了不同細菌菌株產(chǎn)生的硫化氫量，從而識別出產(chǎn)生硫化氫最多的菌株，例如牙齦卟啉單胞菌（Pg）。通過(guò)unisense微電極系統測量硫化氫的濃度，研究人員能夠進(jìn)一步研究硫化氫如何影響宿主細胞，特別是牙齦和口腔上皮細胞產(chǎn)生促炎細胞因子IL-8，從而揭示硫化氫在牙周病炎癥中的作用。牙齦卟啉單胞菌(Pg)在培養過(guò)程中產(chǎn)生的H2S最多，這反過(guò)來(lái)又促進(jìn)了牙齦和口腔上皮細胞產(chǎn)生促炎細胞因子IL-8。IL-8表達的上調在外源性H2S的作用下得以重現。此外不產(chǎn)生主要可溶性毒力因子(即齦肽酶)的Pg突變菌株仍會(huì )產(chǎn)生H2S，并促進(jìn)上皮細胞IL-8的產(chǎn)生，而H2S清除試劑則會(huì )抑制這種作用。這些結果表明，Pg產(chǎn)生的H2S濃度能夠上調牙齦和口腔上皮細胞中誘導的IL-8表達，揭示了可能促進(jìn)牙周病炎癥的機制。Unisense微電極系統癌本研中它為研究人員提供了一種精確、可靠的方法來(lái)測量和分析口腔細菌產(chǎn)生的硫化氫，這對于理解硫化氫在牙周病中的作用機制至關(guān)重要。