干細胞衍生的腦類(lèi)器官是模仿胚胎大腦結構人工培育的微型器官。它們由多種神經(jīng)細胞類(lèi)型組成，具有3D細胞層組織，表現出局部場(chǎng)電位。為了監測厚球形樣本的類(lèi)器官內電活動(dòng)，此項研究開(kāi)發(fā)了能夠穿透腦類(lèi)器官內部區域的長(cháng)突起微電極陣列，以測量類(lèi)器官內神經(jīng)元的局部電位。研究者們開(kāi)發(fā)出了一種新的微加工工藝，可以在垂直上升的超過(guò)兩百微米的橫梁頂端制造突出的懸臂微電極陣列。這些細長(cháng)的橫梁深深插入類(lèi)器官內，可以記錄埋藏在類(lèi)器官內的神經(jīng)元的局部場(chǎng)電位。這種新型裝置將為更詳細地研究神經(jīng)功能提供寶貴的工具。

研究思路

Methods開(kāi)發(fā)一種新的微加工工藝，用于制造長(cháng)的突出式微電極陣列（csMEA），以測量類(lèi)器官內神經(jīng)元的局部電位。為了實(shí)現這一目標，研究人員首先設計了一個(gè)新的微加工流程，然后使用該流程制造了突出式微電極陣列。研究人員將突出式微電極陣列應用于人類(lèi)大腦類(lèi)器官中，以測量神經(jīng)元的電位。最后對實(shí)驗結果進(jìn)行了分析和討論，探討了該技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的潛在應用。

主要結果

ResultsMEA設計研究人員設計了一種csMEA，該陣列由許多微小的彎曲和尖銳的微電極組成，可以穿透組織并靈敏地記錄局部場(chǎng)電位。為了制造這種陣列，研究人員使用了一種新的微加工技術(shù)，該技術(shù)可以制造出足夠尖銳和細長(cháng)的微電極，以直接穿透類(lèi)器官并進(jìn)行電位測量。此外，研究人員還設計了一個(gè)PDMS環(huán)，用于將類(lèi)器官固定在突出式微電極陣列上。為了制造這種陣列，研究人員使用了一種復雜的微細加工流程。該流程包括四個(gè)層次的掩膜制作，制作過(guò)程從清洗玻璃基板開(kāi)始，然后在基板上蒸發(fā)一層厚度為300μm的鋁膜。使用掩膜制作技術(shù)，將鋁膜刻蝕成所需的形狀。然后使用PDMS制作技術(shù)制作懸臂式結構，并將其與微電極陣列結合在一起。最后使用化學(xué)腐蝕技術(shù)將鋁膜層溶解，從而形成懸臂式結構。

圖1(a)MEA的橫截面示意圖。(b)在傳統平面MEA上放置大腦類(lèi)器官的示意圖以及類(lèi)器官插入尖刺微電極的示意圖。(c)功能MEA的照片，顯示PDMS內環(huán)和外環(huán)。(d)顯示與實(shí)際光刻掩模相對應的4個(gè)不同層次的MEA布局。(e)植入MEA并用PDMS環(huán)固定的類(lèi)腦的3D示意圖。

光束釋放

光束釋放是一種微細加工技術(shù)，用于制造懸臂式MEA。該技術(shù)利用了光的能量來(lái)釋放懸臂式結構，從而形成微電極陣列。

圖2尖頭電極微細加工原理示意圖（a）。蝕刻完成后，運動(dòng)的橫梁會(huì )放松內應力并伸直（b）。(c)微光束陣列在光束釋放前后的光學(xué)照片。(d)整個(gè)陣列的掃描電子顯微鏡圖像，(e)顯示每個(gè)光束上活性區域的光束細節。光束正確曲率（f）和過(guò)度曲率（g）示例。(h)一根懸臂末端活動(dòng)區域的細節。

圖3(上圖）分析機械問(wèn)題的示意圖和長(cháng)度不斷增加的松弛懸臂梁的掃描電鏡照片，顯示了圓形變形形狀以及曲率半徑的測量結果。(下圖）曲率半徑與懸臂厚度的關(guān)系，分析模型（藍線(xiàn)）與測量結果（紅點(diǎn)）的比較。

機械建模

在計算受到壓力和力矩作用的機械梁和懸臂的變形形狀時(shí)，可以使用歐拉-伯努利理論或Timoshenko-Ehrenfest梁理論來(lái)建立更精細的模型。接下來(lái)評估懸臂深入插入hESC衍生腦類(lèi)器官的能力。為此，研究者們開(kāi)發(fā)了具有突出懸臂的相同裝置，為了不影響顯微鏡觀(guān)察，沒(méi)有使用金屬層，而是使用與浸入式透鏡兼容的薄玻璃。為了進(jìn)一步了解光束插入類(lèi)器官的空間情況，對懸臂插入的類(lèi)器官進(jìn)行了共聚焦和光片顯微鏡分析。用PLL-FITC標記懸臂，通過(guò)在SiO2和Si3N4上附著(zhù)聚賴(lài)氨酸將熒光素粘合到懸臂上，以便用熒光顯微鏡觀(guān)察懸臂。3D觀(guān)察清楚地表明，橫梁插入了類(lèi)器官中（圖4d-f）。

用掃描電鏡（SEM）觀(guān)察懸臂上被刺穿的類(lèi)器官。在進(jìn)行掃描電子顯微鏡分析時(shí)，除了固定和干燥外，沒(méi)有對類(lèi)器官進(jìn)行任何特殊處理。結果證實(shí)了微光束確實(shí)穿透了類(lèi)器官。如圖4b所示，研究首次使用平面MEA對腦類(lèi)器官進(jìn)行了電生理學(xué)實(shí)驗。研究者開(kāi)發(fā)了穿透性懸臂，以獲得類(lèi)器官內部的電活動(dòng)。結果顯示，可以在所有類(lèi)器官中檢測到自發(fā)信號，每個(gè)電極的平均點(diǎn)燃率為每分鐘0.5個(gè)尖峰（圖5d）。將刺入的類(lèi)器官在MEA上培養了17天，再次進(jìn)行電記錄時(shí)，可以看到它們保持了類(lèi)似的發(fā)射率（圖5d），這表明該過(guò)程在很長(cháng)一段時(shí)間內都是可靠的。這些結果表明，將微電極放置在插入腦器質(zhì)性模型內部的懸臂上，能夠測量因電活躍細胞的電活動(dòng)而產(chǎn)生的局部電位，其振幅可達幾百微伏，具有典型的細胞外記錄形狀。

圖4源自hESC的皮質(zhì)類(lèi)器官及其csMEA植入物的表征。(a)用3毫米PDMS環(huán)固定在懸臂MEA中心的大腦皮質(zhì)類(lèi)器官的透射光顯微鏡觀(guān)察；(b)放置在錐形MEA頂部的大腦皮質(zhì)類(lèi)器官的透射光顯微鏡觀(guān)察。(c)干燥后懸掛在懸臂MEA上的腦類(lèi)器官的掃描電子顯微鏡。(d)共焦圖像采集：將類(lèi)器官植入csMEA。(e)懸臂附近細胞的共聚焦成像。(f)類(lèi)器官脫離csMEA但懸臂仍在其內的光片成像。

圖5懸臂微電極顯示類(lèi)器官內部自發(fā)的電活動(dòng)。(a)對整個(gè)csMEA陣列進(jìn)行的5分鐘電記錄，以及csMEA陣列的代表性照片和示意圖。(b)在植入csMEA 3天和17天后，測量植入csMEA的單個(gè)類(lèi)器官的自發(fā)活動(dòng)尖峰。(c)用一個(gè)電極記錄的類(lèi)器官植入后24小時(shí)和4天的信號軌跡和截圖。隨著(zhù)時(shí)間的推移，記錄到的信號越來(lái)越強，可達數百微伏。(d)植入csMEA 3天和17天的腦類(lèi)器官細胞的平均發(fā)射率。

總結

本研究成功制造出了一種新型csMEA和懸臂式MEA，并且對這兩種陣列進(jìn)行了電位測量和性能測試。研究人員還比較了這兩種陣列的性能，并發(fā)現突出式微電極陣列具有更高的信噪比和更好的空間分辨率，而懸臂式MEA則具有更好的機械穩定性和更高的靈敏度。此外，研究人員還使用這兩種陣列對腦類(lèi)器官進(jìn)行了電位測量，并成功記錄到了神經(jīng)元的活動(dòng)信號。這兩種新型的微電極陣列，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了新的工具。這些陣列具有高精度、高效率和可重復性的優(yōu)點(diǎn)，可以用于記錄神經(jīng)元的活動(dòng)信號，并研究神經(jīng)系統的功能和疾病機制。此外，本文還介紹了一些新的微細加工技術(shù)，如光束釋放和PDMS環(huán)制作技術(shù)，這些技術(shù)可以用于制造其他類(lèi)型的微電極陣列和微型傳感器。因此，本文的研究成果對于微電子學(xué)和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究具有重要的意義。