【摘要】：對于生物體的研究，大多是以細胞為基本單元為基礎展開(kāi)的。人們對細胞的研究大多局限于細胞群體的分析，很難獲得單個(gè)細胞的信息。但是我們知道細胞之間存在個(gè)體差異性，群體分析使很多生物學(xué)研究受到限制，而單細胞分析能夠提供細胞個(gè)體差異性的相關(guān)信息，所以單細胞的研究顯得非常重要。在單細胞層面研究過(guò)氧化氫及膽固醇在細胞膜中的運動(dòng)具有重要的生物學(xué)意義。所以本文基于微電極電化學(xué)方法深入研究了單細胞內過(guò)氧化氫含量及細胞膜中膽固醇的翻轉動(dòng)力學(xué)。研究工作如下：

(1)微電極陣列已用于高通量的單細胞分析研究，然而將細胞培養在單細胞尺寸大小的微洞電極表面之后，再想通過(guò)在電極表面進(jìn)行功能化修飾來(lái)增加信號檢測的靈敏度將會(huì )有一定的難度。因此，論文第一部分研制了納米環(huán)狀電極來(lái)實(shí)現將電極表面和細胞支持面兩者分開(kāi)這一目的；另外，我們還通過(guò)對電極表面進(jìn)行一些功能化修飾來(lái)提高單細胞分析的電化學(xué)靈敏度。通過(guò)電極的電化學(xué)性質(zhì)以及Comsol軟件模擬發(fā)現在納米電極表面，物質(zhì)的擴散速度會(huì )加快，這有利于提高檢測信號。為了證實(shí)功能化修飾后的納米環(huán)狀電極能夠實(shí)現單細胞水平的分析，我們在納米環(huán)狀電極表面電鍍修飾一層普魯士藍，然后用來(lái)檢測單細胞內的過(guò)氧化氫含量。我們制備的功能化修飾后的納米環(huán)狀電極大大提高了電化學(xué)響應，可以檢測到幾百皮安的電流值。經(jīng)過(guò)該功能化修飾過(guò)的納米環(huán)狀電極對于高通量單細胞電化學(xué)分析的發(fā)展起到了一定的促進(jìn)作用。

(2)膽固醇在細胞磷脂雙分子層膜中的運動(dòng)已有相關(guān)研究報道，然而傳統的研究大多采用膽固醇熒光類(lèi)似物方法，對膽固醇熒光類(lèi)似物進(jìn)行檢測，而并不是對膜膽固醇的直接檢測。對此，論文第二部分利用電化學(xué)方法來(lái)實(shí)現無(wú)熒光標記分析檢測。我們使用具有兩個(gè)腔室的縮醛樹(shù)脂杯，在兩腔室間只有一個(gè)50微米大小的微洞是相通的；通過(guò)在微洞上使用二植酰磷脂酰膽堿構建人工磷脂雙分子層膜。我們采用電化學(xué)方法對膽固醇在細胞膜上的時(shí)間動(dòng)力學(xué)進(jìn)行探索研究；另外，還對微電極表面進(jìn)行膽固醇氧化酶修飾來(lái)提高電化學(xué)靈敏度。為了避免在電化學(xué)檢測中所施加的電壓影響人工脂質(zhì)膜的穩定性，實(shí)驗中對膽固醇電化學(xué)信號檢測的最小電壓進(jìn)行了探究，目的是為了能夠檢測膽固醇的同時(shí)維持磷脂雙分子層膜的穩定性。最終確定0.3 V作為膽固醇電化學(xué)檢測的電壓值。實(shí)驗結果表明，膽固醇在磷脂雙分子層膜中的翻轉時(shí)間平均為275s左右，即平均為4.6min左右。這是首次利用非熒光類(lèi)似物的熒光標記方法獲得膽固醇在磷脂雙分子層膜中的翻轉速度，為后期膽固醇在具有病理特征細胞細胞膜中的翻轉研究提供了技術(shù)手段。