在自然界中，細菌常以細菌生物膜的形式存在，其形成給公共衛生、醫療、環(huán)境等關(guān)乎國計民生的重要領(lǐng)域帶來(lái)了諸多不利影響。開(kāi)發(fā)細菌生物膜的高效檢測方法、探究細菌生物膜形成與細菌群體感應(QS)調控的內在聯(lián)系，尋找抑制細菌生物膜形成的有效策略，已經(jīng)成為國內外研究學(xué)者廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。本論文針對細菌生物膜實(shí)時(shí)原位監測、細菌生物膜QS現象實(shí)時(shí)追蹤的研究需求，研制了集成熒光、電阻抗、SERS各種檢測功能的光電傳感檢測芯片。通過(guò)在芯片上構建細菌生物膜生長(cháng)微環(huán)境，利用建立的光電傳感芯片分析檢測方法，實(shí)現了細菌生物膜生長(cháng)狀態(tài)、形成周期規律、分泌QS信號分子動(dòng)態(tài)變化過(guò)程的原位、實(shí)時(shí)、在線(xiàn)監測與高效分析，進(jìn)一步探究了傳統抗生素、中藥活性組分、納米抗菌材料多種類(lèi)型抗菌藥物對細菌生物膜形成及QS信號分子分泌的影響。

本文主要研究工作及結果如下:

(1)微流控芯片上Tannin-Ag NPs抑制大腸桿菌生物膜過(guò)程的原位熒光觀(guān)測設計制備了用于細菌生物膜實(shí)時(shí)熒光觀(guān)測及檢測的多通道微腔陣列PDMS-玻璃復合芯片，建立了細菌生物膜可視化熒光分析檢測方法。制備了平均粒徑為42.37nm的中藥活性組分單寧酸與納米銀的復合納米抗菌材料—單寧酸修飾納米銀(Tannin-Ag NPs)，其對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為16μg/m L。在芯片上通過(guò)實(shí)時(shí)熒光觀(guān)測及熒光定量檢測，考察了Tannin-Ag NPs對大腸桿菌生物膜形成過(guò)程的抑制效果。結果表明，1/2MIC的Tannin-Ag NPs強烈地抑制了大腸桿菌生物膜形成，抑制作用強于相同濃度的單寧酸和Ag NPs。Tannin-Ag NPs改變了大腸桿菌生物膜形成的固有周期，使芯片中大腸桿菌生物膜生長(cháng)期由15 h縮短至9 h。

(2)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生物膜形成過(guò)程的原位無(wú)損電阻抗芯片傳感監測設計制備了集成叉指微電極的電阻抗傳感芯片，建立了區分大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生物膜形成過(guò)程周期節點(diǎn)的阻抗分析方法。利用集成在芯片底部的叉指金微電極，以100 m V的擾動(dòng)電壓，在1～100 KHz的頻率范圍內，對這兩種細菌生物膜在芯片中的生長(cháng)變化過(guò)程進(jìn)行了長(cháng)達48 h的原位阻抗監測。采用包含生物膜電容C_b及生物膜電阻R_b等關(guān)鍵參數的等效電路分析模型，解析了這兩種細菌生物膜的阻抗譜圖。結果表明，隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)，C_b呈先下降后上升的趨勢，而R_b卻呈現出與C_b相反的變化趨勢，這與細菌完成電極表面粘附并逐漸形成成熟生物膜，直到細菌生物膜出現散播的變化過(guò)程密切相關(guān)。此外，沙門(mén)氏菌及大腸桿菌的C_b及R_b發(fā)生改變的時(shí)間節點(diǎn)存在差異，可通過(guò)阻抗檢測方法對這兩種細菌生物膜形成過(guò)程進(jìn)行區分。最后，采用結晶紫染色法證實(shí)了阻抗傳感芯片分析方法解析細菌生物膜形成過(guò)程的正確性。

(3)銅綠假單胞菌生物膜形成過(guò)程中電活性QS信號分子的芯片傳感監測。設計制備了用于銅綠假單胞菌生物膜形成過(guò)程中分泌綠膿菌素原位、實(shí)時(shí)監測的電化學(xué)傳感芯片。在芯片上集成了由工作電極、參比電極和對電極組成的微電極陣列。采用電化學(xué)沉積法在工作電極表面修飾了粒徑大約為100 nm的納米金顆粒。電化學(xué)傳感芯片對綠膿菌素檢測限低至100 n M，在100 n M～200μM范圍內綠膿菌素濃度與峰電流呈現良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數R~2=0.9997。在芯片上對銅綠假單胞菌生物膜形成過(guò)程中產(chǎn)生的綠膿菌素進(jìn)行了長(cháng)達72 h的電化學(xué)監測。結果表明，在銅綠假單胞菌生物膜早期粘附期，綠膿菌素濃度低于1μM，處于較低水平;在生物膜生長(cháng)期，綠膿菌素濃度迅速增加，可增至100μM以上;在生物膜散播期，綠膿菌素濃度又呈現下降趨勢。同時(shí)，研究了中藥活性組分姜黃素對銅綠假單胞菌生物膜分泌綠膿菌素的影響，發(fā)現低于MIC的姜黃素可顯著(zhù)降低綠膿菌素產(chǎn)生水平，最大濃度可降低至38.4μM。

(4)不同抗菌藥物與銅綠假單胞菌生物膜相互作用過(guò)程的SERS芯片檢測和解析。設計制備了用于實(shí)時(shí)原位監測不同抗菌藥物與銅綠假單胞菌生物膜相互作用過(guò)程的微腔陣列SERS芯片。采用化學(xué)自組裝技術(shù)，在芯片中集成了均一性、穩定性良好的納米銀SERS基底，分析增強因子可達1.84×10~8，大大增強了銅綠假單胞菌生物膜拉曼信號，對QS信號分子綠膿菌素檢測限低至10~(-9)mol/L。利用SERS技術(shù)對銅綠假單胞菌與頭孢他啶、中藥活性組分姜黃素和單寧酸三種不同抗菌藥物的相互作用過(guò)程進(jìn)行了長(cháng)達72 h的無(wú)損、原位SERS監測。結果顯示，在0～12 h內，650 cm~(-1)、728 cm~(-1)位置處拉曼峰強度逐漸增加，銅綠假單胞菌生物膜生長(cháng)活躍;在24～36 h內，1350 cm~(-1)位置處綠膿菌素拉曼峰強度很高，產(chǎn)生綠膿菌素QS信號分子;36～72 h后，1350 cm~(-1)位置處綠膿菌素拉曼峰強度降低，其濃度逐漸下降。頭孢他啶、姜黃素、單寧酸對銅綠假單胞菌生物膜生長(cháng)及綠膿菌素抑制作用強弱順序為頭孢他啶姜黃素單寧酸。進(jìn)一步，采用質(zhì)譜法對SERS芯片監測結果進(jìn)行了驗證，表明該SERS芯片及其分析檢測方法能成功用于研究細菌生物膜與抗菌藥物的相互作用過(guò)程。