阿爾茨海默病(AD)和缺血是最常見(jiàn)的兩種腦疾病，兩者存在潛在的聯(lián)系。研究發(fā)現，一方面，腦缺血的病人后續患AD的可能性被大大增強;另一方面，先前患有AD的患者，腦缺血的發(fā)生會(huì )進(jìn)一步加劇認知能力的下降。但是兩種疾病間的病理分子機制的區別和聯(lián)系尚不清楚，因此發(fā)展對缺血和AD關(guān)聯(lián)性分子的研究，對于探索兩者疾病之間的聯(lián)系，疾病的早期診斷和治療均具有十分重要的研究意義。然而由于腦部微環(huán)境復雜、體內外環(huán)境差異大以及體內分子之間相互關(guān)聯(lián)等原因，所以建立高選擇性、高準確度和多物質(zhì)同時(shí)檢測的分析方法仍是一項巨大的挑戰!本課題主要圍繞缺血和AD密切相關(guān)的氯離子及活性硫活體檢測中的選擇性、準確度等關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，設計和構建了系列活體分析新方法，并建立活體分析新方法，成功實(shí)現了缺血和AD鼠腦中氯離子和活性硫的活體分析，為其在缺血及AD疾病模型下鼠腦中的分子機制的研究提供了有效的方法。

主要研究?jì)热萑缦?

(1)基于A(yíng)gNPs可電化學(xué)氧化生成Ag~+，并進(jìn)一步與Cl~-反應生成AgCl的EC反應原理，我們以AgNPs的氧化電位作為Cl~-的測定信號，亞甲基藍(MB)作為內參比信號，成功制備了一種無(wú)標記的可實(shí)時(shí)校準的電化學(xué)傳感，并用于腦缺血和AD鼠腦模型中Cl~-的實(shí)時(shí)監測。結果表明該傳感器對Cl~-呈現具有良好的選擇性，不受生物體常見(jiàn)的干擾物的影響，特別是鹵素陰離子的干擾，對Cl~-在1~300 mM濃度范圍內具有良好的能斯特響應，響應靈敏度為58.3 mV/pCl~-。此外，以MB作為電位矯正的內參比，可以有效消除測定環(huán)境的差異引起的實(shí)驗誤差，顯著(zhù)提高對Cl~-檢測的準確度、重現性與穩定性。最后，結合微電極技術(shù)，我們成功將該傳感器應用于A(yíng)D和缺血兩種腦疾病模型鼠腦中三個(gè)腦區(海馬、紋狀體、皮層)中的Cl~-測定。結果發(fā)現:AD鼠腦海馬區Cl~-水平比正常鼠腦偏低(正常組:100±5 mM(n=5);AD組:64±3 mM(n=5))，其他腦區基本不變。缺血30 min后，紋狀體和海馬中的Cl~-濃度分別下降了19.8±0.5%(n=5)和27.2±0.3%(n=5)，然而皮層中Cl~-濃度并沒(méi)有明顯變化。這些結果為探索Cl~-在腦疾病中的作用提供了有用的數據，也為活體分析中其他離子的檢測方法的建立提供了更準確的分析模式。

(2)設計并構建了一種Turn-on型電化學(xué)生物傳感器用于同時(shí)監測小鼠腦中的內源性H_2S_n和H_2S。首先，借助DFT計算，我們合理設計并合成了對H_2S_n具有特異性響應的新型電化學(xué)探針?lè )肿覯_(PS-1)和M_(PS-2)，以及特異性識別H_2S的探針?lè )肿覯_(HS-1)和M_(HS-2)。鑒于良好的可逆性及電化學(xué)信號無(wú)交叉干擾的特性，M_(PS-1)和M_(HS-2)被最終選定作為H_2S_n和H_2S的探針?lè )肿?，并共組裝在具有抗污染特性的介孔金修飾的碳纖維電極表面，構筑了可同時(shí)檢測H_2S_n和H_2S的電化學(xué)傳感。實(shí)驗結果表明:該傳感器對H_2S_2和H_2S均具有良好的響應，分別在0.2-50μM、0.2-40μM范圍內呈現良好的線(xiàn)性關(guān)系，且同時(shí)檢測無(wú)交叉干擾。此外，該傳感器具有選擇性高、響應時(shí)間快和抗污染能力高等優(yōu)點(diǎn)。最后，基于該傳感，我們成功將其用于活體小鼠腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體中以及腦切片中H_2S_n和H_2S的活體檢測。結果發(fā)現:在鼠腦缺血2 h后及AD模型鼠腦中，H_2S_n的水平均出現升高，而H_2S的水平下降。通過(guò)Western-Blot實(shí)驗發(fā)現:在缺血和AD小鼠腦模型中，TRPA1蛋白的表達與H_2S_n水平變化具有正相關(guān)性。進(jìn)一步的腦切片實(shí)驗表明，在相同量H_2S_n和H_2S的刺激下，H_2S_n激活TRPA1蛋白表達是H_2S的4.4倍。這項研究不僅首次實(shí)現了在兩種鼠腦模型中H_2S_n水平的變化分析，而且為深入闡明H_2S_n和H_2S在腦疾病中發(fā)揮的作用提供了新的見(jiàn)解。

(3)基于表面增強拉曼技術(shù)和PCA技術(shù)相結合，我們構建了一種具有高準確度和高靈敏度的單分子比率型拉曼探針(AuNRs/DEP)，并成功實(shí)現對AD鼠腦模型透析液中多種活性硫的檢測。首先，我們合成了具有表面增強拉曼散射功能的金納米棒(AuNRs)。其次，合理設計并合成了多響應探針?lè )肿樱?-(3，5-二硝基苯氧基)-4-(2-(4-乙炔基苯甲酰氨基)乙基)苯基2-氟-5-硝基苯甲酸酯(DEP)。該分子設計主要由內參比基團和響應基團組成，扮有多重識別功能:第一部分為內參比乙炔基團，其可與AuNRs通過(guò)共價(jià)鍵鍵合，將識別分子DEP一步組裝于納米基底表面;與此同時(shí)，炔基位于生物體內拉曼靜默區，可以作為內參比構建比率型探針，提高測定的準確度。第二部分響應基團分別由醚鍵、酯基和C-F鍵組成，分別作為H_2S，H_2S_n，以及H_2S_n和Cys的識別位點(diǎn)。

接著(zhù)，將DEP分子與AuNRs通過(guò)金炔鍵連接，一步制備了AuNRs/DEP的多功能拉曼探針。該探針對不同活性硫物質(zhì)在不同波長(cháng)處顯示不同的SERS響應。通過(guò)PCA分析可得，PC1與H_2S、H_2S_n和Cys各自的濃度對數都具有有良好的線(xiàn)性關(guān)系，并可實(shí)現三種物質(zhì)的同時(shí)拉曼分析。結合探針良好的分析性能，最終該AuNRs/DEP拉曼探針成功用于A(yíng)D鼠腦模型腦透析液中H_2S、H_2S_n和Cys的同時(shí)監測。