研究簡(jiǎn)介:糖尿病、血壓疾病、超重的發(fā)病率不斷上升以及人口壽命的延長(cháng)是慢性傷口（尤其是下肢傷口）逐年增加的部分原因。迄今為止，醫生使用的最可靠的治療方法之一是銳性清創(chuàng )和去除死亡和感染的組織。然而，由于清創(chuàng )術(shù)很少能清除所有微生物，因此任何殘留的細菌都可能重新繁殖傷口。為了開(kāi)發(fā)新的傷口護理療法，良好的體外模型是必要的。模型越真實(shí)，從實(shí)驗室規模的體外模型獲得的數據轉化為體內條件并且治療在實(shí)踐中取得成功的可能性就越大。本研究中的修改模型基于Chen等人最近發(fā)表的分層慢性傷口生物膜模型(CWB)，其中包含金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。首先基質(zhì)材料從瓊脂變?yōu)槟z原，從而從植物來(lái)源變?yōu)椴溉閯?dòng)物、人類(lèi)相關(guān)材料。研究人員假設改變基質(zhì)可能會(huì )影響抗菌素耐受性。其次模型是在Transwell插入物中鑄造的。這允許在不引入剪切流的情況下從底部交換營(yíng)養物和廢物。據推測，這將使模型能夠在更長(cháng)的時(shí)間內維持生長(cháng)，并在細菌數量和物種間比率方面保持穩定狀態(tài)。第三將原始模型中的生理鹽水替換為磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。研究人員通過(guò)制作這種新的、改良的體外模型的動(dòng)機是創(chuàng )建一個(gè)類(lèi)似傷口的微環(huán)境，在這種微環(huán)境中可以在類(lèi)似體內的條件下測試新穎的局部產(chǎn)品。通過(guò)培養與傷口相關(guān)的病原體，同時(shí)模擬多種環(huán)境因素，例如pH值、氧氣和溫度水平以及營(yíng)養物質(zhì)的持續供應，因為這些因素對潛在的治療有很大影響。該模型使用易于采購的材料在經(jīng)濟上可行，并且易于復制，從而為新傷口治療的半高通量篩選提供機會(huì )。

Unisense微電極系統的應用

使用unisense電化學(xué)微傳感器進(jìn)行氧氣和pH值測量。pH微電極和參比電極的傳感器尖端直徑均為100μm（PH-100,Unisense A/S），氧氣微電極的傳感器尖端直徑為25μm（OX-25，Unisense A/S，)。傳感器連接至微傳感器萬(wàn)用表(Unisense A/S)，并由運行Sensortrace Suite軟件(Unisense A/S)的PC控制。微傳感器尖端位于模型空隙的中間，并以100μm的垂直增量記錄信號，直到1100μm的深度。測量過(guò)程中，模型被放置在恒溫加熱塊上，保持在33°C。

實(shí)驗結果

提出了現有體外模型的修改版本，該模型滿(mǎn)足“理想”體外感染慢性傷口模型的八項擬議標準。它包含WSM，它基于提供半固體環(huán)境的膠原蛋白基質(zhì)，連續添加營(yíng)養物質(zhì)而不在模型內產(chǎn)生剪切流，它表達了幾種類(lèi)型的3D梯度，并且它的表面不包含非哺乳動(dòng)物成分或固體表面。生物膜可以生長(cháng)。建立的模型在6天內保持了金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的穩定比例。此外，它表現出pH值≥8.0的堿性條件和陡峭的氧氣梯度，導致缺氧微環(huán)境，這與慢性傷口中觀(guān)察到的條件相似。因此，它提供了一個(gè)支架，可以在類(lèi)似體內的條件下測試局部傷口治療。測試的三種局部水凝膠均顯示CFU數量顯著(zhù)減少。此外，它們降低了pH值，導致酸性條件，并減少了細菌耗氧量，這都是局部傷口愈合產(chǎn)品所需的品質(zhì)。僅通過(guò)評估存活的病原體來(lái)衡量新抗菌治療的效果是很常見(jiàn)。

圖1、改良的分層慢性傷口生物膜模型示意圖。

圖2、未經(jīng)處理模型隨時(shí)間變化的pH值和氧通量率。圖A中顯示了所有pH深度剖面(n=9)的單個(gè)值、平均值和標準偏差。圖B中顯示了氧氣通量速率(n=9)的單個(gè)值、平均值和標準偏差。pH值的變化使用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn多重比較進(jìn)行測試，包括Dunn校正，以觀(guān)察每個(gè)模型的pH值隨時(shí)間的顯著(zhù)變化。將第0天的數據與第2、4和6天的數據進(jìn)行比較。對于O2通量，使用雙尾Mann–Whitney U檢驗進(jìn)行非參數分析，進(jìn)行配對比較以確定兩個(gè)模型之間的顯著(zhù)差異。

圖3、CWB模型中隨時(shí)間變化的pH值和氧氣梯度。顯示平均值和標準偏差（每個(gè)條件和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=9）。在第0天，測量新鑄造的未經(jīng)處理的模型作為基線(xiàn)。第2天，觀(guān)察細菌對未處理模型的pH值和氧氣的影響。在第4天和第6天，獲得了處理對pH值和氧氣梯度的影響以及未處理模型的梯度。

圖4、mCWB模型中隨時(shí)間變化的pH值和氧氣梯度。顯示平均值和標準偏差（每個(gè)條件和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=9）。在第0天，測量新鑄造的未經(jīng)處理的模型作為基線(xiàn)。第2天，觀(guān)察細菌對未處理模型的pH值和氧氣的影響。在第4天和第6天，獲得了處理對pH值和氧氣梯度的影響以及未處理模型的梯度。

圖5、第2天(A)、第4天(C)和第6天(E)的mCWB概述。所有天均觀(guān)察到金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的小菌落：第2天（B）、第4天（D）和第6天（F）。金黃色葡萄球菌=綠色，銅綠假單胞菌=紅色，死細菌=藍色。

結論與展望

本論文研究了一種新的體外慢性傷口生物膜模型，該模型提供了模擬哺乳動(dòng)物組織成分的分層支架，可以在其上測試局部傷口護理產(chǎn)品。研究人員進(jìn)一步更新了模型，以模擬營(yíng)養物質(zhì)從下方的動(dòng)態(tài)流入，就像慢性傷口的情況一樣。改良的體外模型是使用膠原蛋白代替瓊脂作為主要基質(zhì)成分創(chuàng )建的，并且包含金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。該模型被鑄造在Transwell插入物中，然后放置在傷口模擬介質(zhì)中，從而允許營(yíng)養物質(zhì)和廢物通過(guò)過(guò)濾器進(jìn)行交換。使用三種潛在的傷口護理產(chǎn)品和作為陽(yáng)性對照的二葡萄糖酸氯己定2%溶液來(lái)評估模型。測試的產(chǎn)品由攜帶不同活性化合物的完全生物降解淀粉微球制成的水凝膠組成。將化合物局部涂抹并放置2-4天。使用unisense微電極剖面分析系統測量氧氣濃度和pH值，以評估處理對細菌活性的影響。獲得模型的共焦顯微鏡圖像以可視化微菌落的存在。研究結果表明，改良的體外模型在6天內保持了兩種細菌種類(lèi)的穩定數量。在未經(jīng)處理的模型中，形成陡峭的氧氣梯度并且pH值增加至>8.0。含有活性化合物的水凝膠可緩解高耗氧量并大幅降低pH值。此外，與氯己定對照處理相比，所有三種水凝膠均顯著(zhù)且更大程度地減少了集落形成單位。修改后的模型表現出與體內慢性傷口相似的幾個(gè)特征。